高效液相色譜法快速檢測酸奶及蛋白飲料中三聚氰胺

摘要：三聚氰胺是非常親水的小分子，在常規的反相色譜中不保留，因此不能與其他物質進行分離。本方法的原理是試樣中三聚氰胺經水和乙腈提取后，用高效液相色譜測定，外標峰面積法定量。標準工作曲線相關系數為R=0.99998。精密度試驗RSD為0.3%，樣品的加標回收率在98.37～99.75%之間。酸奶及蛋白飲料中三聚氰胺快速檢測方法靈敏度及準確度符合要求。

關鍵詞：三聚氰胺 高效液相色譜法 快速 酸奶 蛋白飲料

蛋白質主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺的分子式含氮量為66％左右。通用的蛋白質測試方法“凱氏定氮法”是通過測出含氮量來估算蛋白質含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質測試含量偏高，從而使劣質食品通過食品檢驗機構的測試，終于爆發了三鹿奶粉事件。

三聚氰胺簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式C3N6H6、其結構式①分子量126.12，為純白色單斜晶體，比重1.573(14℃)，熔點354℃，300℃升華，顯弱堿性，能溶于甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘吡啶，微溶于水(3.1g/L，常溫)及醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，能夠與各種酸反應生成三聚氰胺鹽。在強酸或強堿液中，三聚氰胺發生水解，氨基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。

三聚氰胺是非常親水的小分子，在常規的反相色譜中不保留，因此不能與其他物質進行分離。一般情況下，對于親水性的化合物可以在溶劑中加入離子對試劑，使樣品在反相柱上保留，與其他雜質進行分離。在對三聚氰胺的檢測中，加入的是辛烷磺酸鈉(sodium octane sulfonate)。但是國標方法檢測需4個小時，這對于企業來說有一定的局限性，尤其是乳品企業。現在介紹一種利用高效液相色譜法檢測原料乳中的三聚氰胺的快速方法，本方法的定量限為2mg/kg。

1 原理

試樣中三聚氰胺經水和乙腈提取后，用高效液相色譜測定，外標峰面積法定量。

2 試劑

方法中所用試劑，除另有規定外，均為分析純試劑，水為超純水。

①乙腈：色譜純。②檸檬酸：分析純。③辛烷磺酸鈉：色譜純。④甲醇水溶液：準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。⑤三聚氰胺標準品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%。⑥三聚氰胺標準儲備液：精密稱取三聚氰胺0.0100g，用甲醇水溶液（2.4）溶解并定容至100mL的容量瓶中，混勻，即得100ug/mL三聚氰胺標準儲備液。于4℃避光保存。保存期1個月。⑦微孔濾膜：0.45 μm，有機相。

3 儀器和設備

①高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。②分析天平：感量為0.0001g和0.01g。③離心機：轉速不低于400

0r/min。④超聲波水浴。⑤渦旋混合器。⑥具塞塑料離心管：50mL。

4 分析步驟

4.1 樣品處理 準確稱取5.0g（精確至0.01g）試樣于50ml容量瓶中，加10ml乙腈溶解，用超純水定容至50mL，振蕩混勻后超聲提取10-20min，離心，3500-4000轉/分鐘以上離心10分鐘，經0.45um濾膜過濾，HPLC分析。

4.2 測定

4.2.1 HPLC色譜條件：分析柱：C8 4.6mm×250mm，5.0um；流動相：準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，調節pH至3.0后，定容至1L備用；流速：1.0mL/min；進樣量：10ul；柱溫：40℃；波長：240nm；檢測器：紫外檢測器，236nm波長。根據保留時間定性，外標峰面積法。

4.2.2 標準曲線：用不含鹽的流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0，1.0，2.0，2.5，5.0，10.0，20.0mg/kg的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。基質匹配加標三聚氰胺的樣品HPLC色譜圖參見②。

4.2.3 結果計算

試樣中三聚氰胺的含量按下式進行計算：X=C×V/m/1000×1000

式中：X——試樣中三聚氰胺的含量，單位為mg/kg；C——經查標準曲線計算所得進樣液的濃度，單位為mg/kg；V——試樣總稀釋體積，單位為ml；m——樣品量，單位為ml。計算結果保留三位有效數字。

5 線性實驗

實驗表明，樣品中三聚氰胺的質量濃度在0-20mg/kg內標準曲線呈線性范圍，曲線的回歸方程為：y=29.17897x-1.87222，相關系數為R=0.99998。三聚氰胺的標準工作曲線見下圖：

6 精密度實驗

重復測定標準溶液8次，將得到的濃度進行計算得到相對標準偏差。測定結果見下表所示：

7 準確度實驗

通過在樣品中人為添加三聚氰胺標樣得到不同濃度的三聚氰胺加標樣品，通過樣品空白及加標樣品的測定結果，得到回收率，結果見下表：

8 結論

利用高效液相色譜儀測定了酸奶中三聚氰胺的含量，其中三聚氰胺的濃度在0～10mg/kg范圍內線性關系良好，精密度為0.30%。樣品的加標回收率在98.37～99.75%之間。

注釋：①三聚氰胺分子結構圖

②三聚氰胺色譜圖

參考文獻：

[1]結構式圖片由yangke19941112提供.

[2]性質、用途——化工詞典.

[3]GB/T 22388-2008.