節(jié)旋藻實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇

摘 要:本實驗利用實時熒光定量PCR對極大節(jié)選藻中16SrRNA、TEF(翻譯延伸因子，GTPases)、RPL13(核糖體蛋白)、PSR(藻藍蛋白β亞基)、CYP(親環(huán)素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、Hsp(熱休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70 因子)八個候選基因在正常生長和持續(xù)光照條件下的穩(wěn)定性進行了檢測。用geNorm軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，從中選出合適的內(nèi)參基因。結(jié)果表明RPL13和CYP38可以作為正常生長和持續(xù)光照處理下極大節(jié)選藻節(jié)律性研究通用的內(nèi)參基因16SrRNA基因的穩(wěn)定性要低于其他的候選內(nèi)參基因，并不是一個合適的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞:節(jié)旋藻 內(nèi)參基因 實時熒光定量PCR geNorm 生物節(jié)律

中圖分類號:Q78文獻標識碼:A文章編號:1672-3791(2012)06(c)-0102-01

用實時熒光定量PCR進行相對定量時，需選取在不同實驗條件下表達恒定的基因作為內(nèi)參對目標基因的表達量進行校正。常用的內(nèi)參基因有GAPDH、β-actin、18SRNA、16SRNA、RPL13、Cyclophilin等，然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)常用的內(nèi)參基因存在一些缺陷。Revillion等[1]發(fā)現(xiàn)GAPDH mRNA在不同癌組織、不同個體間以及細胞周期的不同階段變化較大。18SrRNA和16SrRNA作為內(nèi)參也遭到了質(zhì)疑。Tricarico等[2]認為對于已純化mRNA中的目標基因進行定量時，rRNA不能用于標準化;相對于大部分目標基因，rRNA的表達量太高，不能真實的反映目標基因的降解情況。

1 材料與方法

將節(jié)旋藻Arthrospira FACHB 438于Zarrouk液體培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)期。培養(yǎng)條件為23℃恒溫，光強30μmol·m-2·s-1，12L/12D培養(yǎng)。藻液黑暗處理12h以達到同步化后，分別進行持續(xù)光照處理和正常培養(yǎng)。每隔4小時收一次藻，收集48小時，共得到26個樣品組，兩種實驗條件下各13個。材料用上海飛捷公司RNAfast200提取試劑盒提取總RNA，用1%的瓊脂糖電泳檢測質(zhì)量;用微量定量儀測定濃度和純度。取800ng消化后的總RNA加100prmol的六堿基隨機引物，按照反轉(zhuǎn)錄操作流程合成cDNA。根據(jù)候選內(nèi)參基因序列設(shè)計引物，使PCR擴增效率(E)在95%到110%之間。

q-rt-PCR在ABI 7500 Real-time PCR Systerm上進行。反應(yīng)體系按照試劑說明配制。實驗過程分八次熒光定量PCR反應(yīng)進行，每次檢測一個基因，每個基因的檢測包括每個樣品中此基因的熒光定量PCR和標準曲線的繪制。基因的標準曲線是用極大節(jié)旋藻FACHB438的基因組DNA為模板，稀釋10、102、103、104、105、106、107倍7個濃度梯度，然后以模板稀釋倍數(shù)的對數(shù)值為橫軸，平均Ct值為縱軸做標準曲線。用geNorm軟件篩選內(nèi)參基因時首先樣品Ct值利用2-△Ct法轉(zhuǎn)化成基因表達量值Q，具體做法如下[3]:將同一基因所有樣品中Ct值最小的樣品Q值設(shè)為1，同一基因其余樣品的Q值用下面兩式計算:Q=EdeltaCt(1)，deltaCt=minCt-sampleCt(2)。其中E為擴增效率，可通過標準曲線斜率計算得到，公式為:E=10-1/斜率。GeNorm程序?qū)⒘恐礠作為輸入文件，把某一看家基因與其他看家基因的表達量值進行兩兩比對，然后將得到的比值經(jīng)過對數(shù)變換，再計算這些對數(shù)值的標準差，并以此作為這個基因的表達穩(wěn)定性M。M值越高，說明該基因的穩(wěn)定性越差;M值越低，說明該基因的穩(wěn)定性越好。

2 結(jié)果與討論

研究發(fā)現(xiàn)，使用單一內(nèi)參基因比使用2個或以上數(shù)目的內(nèi)參基因引起的誤差高3～6.4倍。GeNorm篩選出2個以上的內(nèi)參基因。在正常生長組，平均M值最低即表達穩(wěn)定性最好的兩個基因為CYP和RPL13，M值分別為1.50和1.45，16SrRNA的M值高達1.883在光照處理組，平均M值最低即表達穩(wěn)定性最好的兩個基因也為CYP和RPL13，M值分別為1.379和1.528，16SrRNA基因的M值高達2.195。16SrRNA在光照處理組和正常生長組相比于CYP和RPL13均未表現(xiàn)出較好的表達穩(wěn)定性，也意味著16SrRNA并不是一個合適的內(nèi)參基因。

藍藻作為地球上最古老的物種之一，具有重要的研究價值。目前針對藍藻的研究主要集中在其耐鹽機制、耐堿機制以及藍藻高效的CO2利用率。其中16S rRNA被默認為在所有實驗條件下的表達量都是穩(wěn)定的。但本研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA的穩(wěn)定性都比較差。在GeNorm分析中，GAPDH、16S rRNA和Hsp基因的M值最高，表明它們不適合作為內(nèi)參;光照處理組中基于平均M值分析，表達穩(wěn)定性最高的是CYP和RPL13基因，在正常生長組，基于平均M值分析，表達最穩(wěn)定的基因是RPL13和CYP基因。RPL13基因良好的穩(wěn)定性在真核生物部分生物的研究中已經(jīng)得到證實。CYP基因是親環(huán)素家族一員，它在節(jié)旋藻光系統(tǒng)Ⅱ中起關(guān)鍵作用，而且它在環(huán)境脅迫下的馬鈴薯中具有很好的表達穩(wěn)定性。

參考文獻

[1]Revilion F，et al.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression in human breast cancer [J]. Eur J Cancer，2000，36(8):1038～1042.

[2]Tricarico C，et al Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction:normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies [J]. Analytical Biochemistry，2002，309(2):293～300.

[3]Vandesompele J et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol，2002 3:7.