乳酸菌的培養(yǎng)

摘 要:乳酸菌是發(fā)酵食品中應(yīng)用最為廣泛的細(xì)菌之一。基于其特殊的生理功能，在發(fā)酵工程中，首先要選育優(yōu)良菌種，但由于微生物在自然條件下都是雜居混生的，因此要選育良種，就必須對其中的純種微生物進(jìn)行分離或鑒定。

關(guān)鍵詞:乳酸菌 生理 鑒定

中圖分類號:TS252.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1672-3791(2012)06(c)-0093-01

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱，主要包括乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌及雙歧桿菌等。

1 乳酸菌的生理功能

乳酸菌的生理功能主要有:(1)具有粘附性和定植能力。(2)產(chǎn)生抑菌活性的代謝產(chǎn)物。(3)降低膽固醇。(4)具有抗變異原性。(5)改善肝臟功能。(6)增強(qiáng)免疫功能。

2 乳酸菌的類型

乳酸菌大體上可分為兩大類。一類是動物源乳酸菌，一類是植物源乳酸菌。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 樣品

市售進(jìn)口奶酪。

3.1.2 培養(yǎng)基

(1)MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三銨1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐溫80 1.0g、蒸餾水1000mL。(pH 6.2～6.4，121℃，滅菌20min)。

(2)BCG培養(yǎng)基:A、B液滅菌后混勻。A液:脫脂奶粉50g，1.6%溴甲酚綠酒精液0.35ml，蒸餾水250ml.(90℃，開蓋滅菌10min).B液:酵母膏5g，瓊脂10g，蒸餾水250ml。(pH 6.8，121℃滅菌20min)A、B液滅菌后在無菌狀態(tài)下混勻后倒平板。

3.2 方法

3.2.1 樣品的處理

奶酪的處理:以無菌操作取奶酪1g，放入含有9mL滅菌加熱至含40℃左右的生理鹽水的滅菌廣口瓶內(nèi)，待奶酪溶解制成1∶10的均勻稀釋液，并用無菌生理鹽水逐級稀釋至10-3、10-4、10-5。

3.2.2 乳酸菌的分離純化

采用BCG牛乳培養(yǎng)基對稀釋樣品中的微生物通過平板傾注法進(jìn)行分離純化。以無菌操作取奶酪稀釋液10-3、10-4、10-5各0.1mL置于滅菌后的平板中，加入15mL BCG牛乳培養(yǎng)基，帶培養(yǎng)基凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果稍扁平的黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，初步定為乳酸菌。

3.2.3 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

配制MRS液體培養(yǎng)基，分裝到試管中(每管約15mL)，將選出的菌種接種到試管中在37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24h，在接種到小三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)24h。

3.2.4 乳酸菌的鑒定

(1)形態(tài)學(xué)觀察。

挑選出產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株，在合適的培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h，待長出單菌落觀察其菌落特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察其觀察菌體形狀、排列方式、有無芽孢等個體形態(tài)特征。

(2)生理實(shí)驗。

①經(jīng)固體培養(yǎng)基分離和液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)的嗜熱鏈球菌接種于脫脂乳中，在不同溫度下培養(yǎng)發(fā)酵，結(jié)果嗜熱鏈球菌在40℃左右時約需3h凝乳;在45℃以上，隨著溫度提高，凝乳時間延長；當(dāng)培養(yǎng)溫度大于55℃時，沒有凝乳發(fā)生。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于40℃時，隨著培養(yǎng)溫度的降低，凝乳時間延長；當(dāng)溫底低于25℃時，不能凝乳。

②將普通濾紙剪成約0.5cm～0.6cm寬的紙條，長度根據(jù)試管和培養(yǎng)基高度而定。用濃度為50～100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘干，放入培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，滅菌后備用。將新鮮試驗菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)液后，用無菌的鑷子夾取一乙酸鉛紙條懸掛于接種管內(nèi)。下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。試驗中設(shè)空白對照，在未接種的試管培養(yǎng)上懸掛乙酸鉛紙條。另外接種已知菌的陰性反應(yīng)作對照。置于37℃培養(yǎng)培養(yǎng)1d～3d，進(jìn)行觀察比較，紙條變黑為陽性反應(yīng)。

(3)乳酸菌的保藏

將具有較強(qiáng)抑菌活性的乳酸菌活化培養(yǎng)，并加入一定的保護(hù)劑，在-76℃及真空下凍干3d后，放-20℃冰箱貯藏。

4 結(jié)果與分析

4.1 乳酸菌的鑒定

4.1.1 形態(tài)學(xué)觀察(表1)

4.1.2 生理特征鑒定

根據(jù)生理生化實(shí)驗結(jié)果，經(jīng)過刪選比對，菌株GL5的生理生化特性與干酪乳桿菌最相似。

5 結(jié)論

5.1 分離純化結(jié)果

利用BCG培養(yǎng)基分離出市售干酪中單菌落，經(jīng)觀察菌落形態(tài)與革蘭氏染色初步判定為乳酸菌。

5.2 鑒定結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)觀察與生理生化實(shí)驗，菌株GL5初步鑒定為干酪乳桿菌。

參考文獻(xiàn)

[1]楊潔彬，葛興華．乳酸菌生物學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用[M]．北京:中國輕工業(yè)出版社，1996．

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