乳酸菌的培養

摘 要:乳酸菌是發酵食品中應用最為廣泛的細菌之一。基于其特殊的生理功能，在發酵工程中，首先要選育優良菌種，但由于微生物在自然條件下都是雜居混生的，因此要選育良種，就必須對其中的純種微生物進行分離或鑒定。

關鍵詞:乳酸菌 生理 鑒定

中圖分類號:TS252.1文獻標識碼:A文章編號:1672-3791(2012)06(c)-0093-01

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類可發酵碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱，主要包括乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌及雙歧桿菌等。

1 乳酸菌的生理功能

乳酸菌的生理功能主要有:(1)具有粘附性和定植能力。(2)產生抑菌活性的代謝產物。(3)降低膽固醇。(4)具有抗變異原性。(5)改善肝臟功能。(6)增強免疫功能。

2 乳酸菌的類型

乳酸菌大體上可分為兩大類。一類是動物源乳酸菌，一類是植物源乳酸菌。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 樣品

市售進口奶酪。

3.1.2 培養基

(1)MRS液體培養基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三銨1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐溫80 1.0g、蒸餾水1000mL。(pH 6.2～6.4，121℃，滅菌20min)。

(2)BCG培養基:A、B液滅菌后混勻。A液:脫脂奶粉50g，1.6%溴甲酚綠酒精液0.35ml，蒸餾水250ml.(90℃，開蓋滅菌10min).B液:酵母膏5g，瓊脂10g，蒸餾水250ml。(pH 6.8，121℃滅菌20min)A、B液滅菌后在無菌狀態下混勻后倒平板。

3.2 方法

3.2.1 樣品的處理

奶酪的處理:以無菌操作取奶酪1g，放入含有9mL滅菌加熱至含40℃左右的生理鹽水的滅菌廣口瓶內，待奶酪溶解制成1∶10的均勻稀釋液，并用無菌生理鹽水逐級稀釋至10-3、10-4、10-5。

3.2.2 乳酸菌的分離純化

采用BCG牛乳培養基對稀釋樣品中的微生物通過平板傾注法進行分離純化。以無菌操作取奶酪稀釋液10-3、10-4、10-5各0.1mL置于滅菌后的平板中，加入15mL BCG牛乳培養基，帶培養基凝固后放入恒溫培養箱中，37℃恒溫培養24h。觀察結果稍扁平的黃色菌落，周圍培養基變為黃色，初步定為乳酸菌。

3.2.3 菌種的擴大培養

配制MRS液體培養基，分裝到試管中(每管約15mL)，將選出的菌種接種到試管中在37℃條件下擴大培養24h，在接種到小三角瓶中擴大培養24h。

3.2.4 乳酸菌的鑒定

(1)形態學觀察。

挑選出產抑菌物質的菌株，在合適的培養基上劃線培養24h，待長出單菌落觀察其菌落特征，在光學顯微鏡下觀察其觀察菌體形狀、排列方式、有無芽孢等個體形態特征。

(2)生理實驗。

①經固體培養基分離和液體培養基擴大培養的嗜熱鏈球菌接種于脫脂乳中，在不同溫度下培養發酵，結果嗜熱鏈球菌在40℃左右時約需3h凝乳;在45℃以上，隨著溫度提高，凝乳時間延長；當培養溫度大于55℃時，沒有凝乳發生。當培養溫度低于40℃時，隨著培養溫度的降低，凝乳時間延長；當溫底低于25℃時，不能凝乳。

②將普通濾紙剪成約0.5cm～0.6cm寬的紙條，長度根據試管和培養基高度而定。用濃度為50～100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘干，放入培養皿或試管內，滅菌后備用。將新鮮試驗菌培養物接種于培養液后，用無菌的鑷子夾取一乙酸鉛紙條懸掛于接種管內。下端接近培養基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。試驗中設空白對照，在未接種的試管培養上懸掛乙酸鉛紙條。另外接種已知菌的陰性反應作對照。置于37℃培養培養1d～3d，進行觀察比較，紙條變黑為陽性反應。

(3)乳酸菌的保藏

將具有較強抑菌活性的乳酸菌活化培養，并加入一定的保護劑，在-76℃及真空下凍干3d后，放-20℃冰箱貯藏。

4 結果與分析

4.1 乳酸菌的鑒定

4.1.1 形態學觀察(表1)

4.1.2 生理特征鑒定

根據生理生化實驗結果，經過刪選比對，菌株GL5的生理生化特性與干酪乳桿菌最相似。

5 結論

5.1 分離純化結果

利用BCG培養基分離出市售干酪中單菌落，經觀察菌落形態與革蘭氏染色初步判定為乳酸菌。

5.2 鑒定結果

通過形態學觀察與生理生化實驗，菌株GL5初步鑒定為干酪乳桿菌。

參考文獻

[1]楊潔彬，葛興華．乳酸菌生物學基礎與應用[M]．北京:中國輕工業出版社，1996．

[2]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社，1999:6～16．