新型核酸分子熒光探針
——分子信標的研究進展

余麗麗，姚 琳，楊黎燕，李仲謹

(1.西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學化學與化工學院，陜西 西安 710021)

1952年Chargaff發現了堿基互補配對原理，1953年Watson和Crick在此基礎上提出了DNA雙螺旋模型，這兩大發現既是生物分子識別史上最重大的發現，又是核酸分子熒光探針分子信標(Molecular beacon，MB)的理論基礎。許多分子生物學和核酸化學合成的研究突破都得益于MB的發展，從20世紀60年代初至今，MB已被廣泛地應用于生物、藥物、化學等多個領域[1～3]。近年來，MB特別是基于DNA結構的MB，已成為一種重要工具，用于核酸的復制、重組、翻譯和表達的研究。為了滿足后基因組時代的發展需求，人們通過各種分子工程策略，發展了許多敏銳性更高、選擇性更優的MB。

作者在此對MB的結構、設計原理、熱力學研究、選擇性與動力學研究進行了綜述，并對非典型MB(LNA-MB、SQ-MB)進行了介紹。

1 MB的結構

1996年，Tyagi和Kramer首次共同提出了MB的概念。MB是一種單鏈寡核苷酸探針，具有獨特的莖環狀(也稱發夾型)結構，其結構一般包括4個部分：(1)環狀區(Loop)：一段長度為15～30個堿基的目標識別區域，可與待測核酸序列互補配對，達到識別的目的；(2)莖干區(Stem)：兩段長度為5～8個堿基的互補序列；(3)熒光基團：一般連接在MB的5′-端，常見的熒光基團是熒光素(Fluoresein)；(4)猝滅基團：連接在MB的3′-端，常見的猝滅基團有Dabcyl、BHQ-1和BHQ-2(圖1)，基于以上猝滅基團的猝滅效率在85％～97％之間。

圖1 常見的熒光猝滅基團

2 MB的設計原理

在沒有檢測序列時，MB構成一個莖-環結構(Stem-Loop)，熒光基團和猝滅基團彼此緊鄰，熒光基團將外界給予的大部分能量傳遞給猝滅基團，猝滅基團吸收能量后以熱的形式散發；少部分未被猝滅基團吸收的能量通過發射熒光釋放，此過程即為熒光共振能量傳遞(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)[4～6]，常將此時的結構稱為發夾結構，如圖2所示。

圖2 MB的設計原理

在檢測序列時，MB的發夾結構打開，猝滅基團與熒光基團有效分離，熒光得以恢復，Loop段與檢測序列形成比發夾結構中的Stem雙螺旋結構更長、更穩定的雜交雙螺旋結構。

大多數MB的設計都基于FRET，該情況下大量的能量傳遞都不以光的形式釋放，而是通過非輻射途徑——熱的形式釋放，有效地提高了猝滅效率，降低了背景噪音。

3 MB的熱力學研究

大部分情況下，MB與目標分子的雜交可以用熱力學系統解釋。一個簡單的開/關模型可近似描述反應的最初和最終狀態。該模型可通過實驗數據支持：當MB與檢測序列完全互補時，形成的雙螺旋結構解旋溫度(T0)為42 ℃；而當檢測序列中有1個堿基錯配時，形成的雙螺旋結構解旋溫度(Tm)在28～31 ℃之間。該模型描述了檢測序列中1個堿基錯配對檢測序列與MB形成的雙螺旋結構Tm的影響：錯配堿基位置與Loop中心區域越接近，對Tm的影響越大，Tm與T0的差距也越大[7～9]。

MB和線性DNA/RNA探針在熱力學上的研究不僅說明了Tm和選擇性之間的關系，同時也解釋了為什么MB比線性DNA/RNA探針的選擇性更強。首先，線性DNA/RNA探針有2種可能存在的狀態：自由態、與檢測序列互補形成雙螺旋結構[10]；而MB有3種可能存在的狀態：與檢測序列雜交形成雙螺旋結構(Phase 1)、發夾結構(Phase 2)、隨機盤繞結構(Phase 3)，如圖3所示。

圖3 MB在體系中的3種不同狀態

MB的選擇性取決于完全互補的檢測序列-MB形成的雙螺旋結構的解旋溫度(T0)與1個堿基錯配的檢測序列-MB形成的雙螺旋結構的解旋溫度(Tm)的差異性。熱力學研究表明，MB在發夾結構的自由能低于在隨機盤繞結構的自由能[7,8,10～13]，這意味著，雜交最易發生在溫度改變引起的雙螺旋結構相變到發夾結構過程中，而未過渡到隨機盤繞結構之前。Stem螺旋結構越長，完全配對的雙螺旋結構和含錯配堿基的雙螺旋結構的解旋溫度差別越大，MB的結構越穩定、選擇性越優。

4 MB的選擇性與動力學研究

相對于線性DNA/RNA探針，MB表現出較優的選擇性，這得益于MB的發夾結構，此外，MB還可通過優化序列提高它的選擇性[8，14]。熱力學研究表明，通過增加Stem的長度和穩定性可以有效地提高選擇性，而提高選擇性的最簡單方法則是增加Stem序列中G、C的含量。但是，隨著MB中Stem螺旋結構穩定性的提高，它的雜交速率會有所減慢。線性DNA探針長度為17～19個堿基時，它的雜交速率常數在1×104L·mol-1·s-1左右；但是MB的Stem長度從4個堿基增加到6個堿基時，雜交速率常數從5000 L·mol-1·s-1降到40～300 L·mol-1·s-1[8]，如圖4所示。

圖4 雜交速率與Stem長度的關系

Stem序列長度縮短，會導致背景噪音的增大和選擇性的下降。通常來說，Stem序列長度在5～7個堿基之間、Loop長度在15～25個堿基之間，能使選擇性和雜交速率常數都維持在可接受范圍。因此，平衡Stem序列長度縮短帶來的選擇性降低和Stem序列長度增長帶來的雜交速率常數降低這二者的矛盾，是研究者面臨的一個挑戰。其中一種策略是使用更長的Stem序列(Stem序列包含與目標序列結合的Loop序列部分)，該方法可以實現雜交速率的加快，且不需犧牲特殊增長的Stem序列。

選擇性與雜交速率的矛盾還受溫度的影響。在MB的實際應用中，溫度是一個重要的外在影響因素。較高的溫度會使自由的MB從發夾結構轉變到隨機盤繞結構，在隨機盤繞結構時，MB的熒光恢復，帶來背景噪音。實際應用過程(如活體成像、即時PCR檢測)中，溫度一般高于25 ℃。當溫度高于50 ℃時，發夾結構開始轉變到隨機盤繞結構，此時，它們作為無效的MB同時還引入較高的背景噪音[8,10]。因此，MB需要穩定的Stem結構以減少被檢測到的背景噪音熒光[4，15]。現階段，已經發展了一些新型的溫度穩定型Stem系統解決了這個問題。

5 非典型MB介紹

5.1 鎖核酸分子探針(LNA-MB)

為解決溫度過高引起發夾結構轉變為隨機盤繞結構而引起較高的背景噪音的問題，研究人員合成了鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)MB。LNA中的核糖是一個雙環呋喃糖結構，此結構使得堿基與核糖之間的鏈接鍵不能隨意轉動，分子的穩定性更高(圖 5)。而且LNA-DNA雜交能力比DNA-DNA雜交能力更強[16～18]，所以LNA-MB的選擇性也明顯強于DNA-MB。在95 ℃時，RNA或DNA都已經發生變性，但LNA-MB能夠保持穩定的發夾結構，且LNA-MB與目標DNA仍能保持雜交狀態。因此，LNA-MB被廣泛應用于普通DNA-MB不適用的高溫生物學研究。

圖5 LNA-MB的結構

5.2 超級猝滅基團分子探針(SQ-MB)

SQ-MB是一個一端具有多個猝滅基團的熒光分子探針，如圖6所示。

圖6 包含有3個猝滅基團的SQ-MB

近年來，MB被廣泛地應用于生物技術研究的各個領域。但由于MB結構中的熒光基團不能被有效地猝滅，較高的背景噪音嚴重影響了實際應用過程中測試結果的準確性。因此，通過結構的優化以降低體系的背景噪音越來越受到關注。據報道，應用多個猝滅基團與一個熒光基團配對，可以有效地提高猝滅效率。這是由于多個猝滅基團可以提高吸收效率、增強猝滅基團與熒光基團間的偶極-偶極配位能力，從而提高猝滅效率[17]。

6 結語

MB是近幾年發展起來的一種新型檢測技術，具有高靈敏度、高選擇性等優點，廣泛應用于分子生物學、生化分析等諸多領域。今后，MB的主要發展方向為：(1)其它形態(如啞鈴型)MB的設計合成和研究；(2)三螺旋結構的MB的探討研究；(3)通過猝滅基團的設計和研究，以降低背景噪音。

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