野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液催化合成α-熊果苷

張欣英，嚴 偉，李群良，姚評佳，魏遠安，唐紀良

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004)

熊果苷(Arbutin)，又名熊果甙、熊果素、熊果葉甙、熊果酚甙或楊梅甙，是一種源于杜鵑花科熊果屬的多年生常綠小灌木植物熊果的葉子的成分。熊果苷具有美白活性，廣泛應用于化妝品行業(yè)[1]，其美白機理為熊果苷對酪氨酸酶產(chǎn)生競爭性及可逆性抑制，從而阻斷多巴及多巴醌的合成，進而抑制黑色素的生成，達到美白效果[2]。熊果苷依結(jié)構(gòu)不同可分為α型(4-羥苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)和β型(4-羥苯基-β-2-D-吡喃葡萄糖苷)，α-熊果苷是β-熊果苷的差向異構(gòu)體,α-熊果苷抑制黑色素的活性為β-熊果苷的10倍[3]。作為最好、最安全的高效美白劑，α-熊果苷在國際化妝品領(lǐng)域占有極其重要的地位，而我國α-熊果苷的開發(fā)和利用仍處于起步階段。因此，研究α-熊果苷的合成意義重大[4]。

目前制備α-熊果苷的方法主要有微生物細胞轉(zhuǎn)化法和酶法，其中微生物細胞轉(zhuǎn)化法是利用不同微生物的酶進行糖轉(zhuǎn)移反應,使1分子的葡萄糖和1分子的氫醌結(jié)合形成單一的α-熊果苷[5，6]，但酶法合成α-熊果苷更具優(yōu)勢，如王秀捧等[7]、劉春巧等[8]利用嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia) BT-112催化合成α-熊果苷。

作者在此利用野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004胞內(nèi)粗酶液生物催化合成α-熊果苷，并對反應條件進行了初步研究。其反應方程式為：

1 實驗

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004 由廣西亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室唐紀良教授提供；α-熊果苷，Sigma 公司；生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；其它試劑均為分析純。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，％)：蔗糖1.0，蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，酵母膏0.1，pH值7.0。

1.2 野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液的制備

無菌條件下，取一環(huán)菌種于種子培養(yǎng)液中在28 ℃、180 r·min-1下發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，吸取發(fā)酵液，于新種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，冷凍離心(8000 r·min-1，20 min),收集菌體;用緩沖溶液洗滌菌體2次，低溫超聲破碎，離心；取上清液，即為胞內(nèi)粗酶液(濕菌體濃度為50 mg·mL-1)。

1.3 α-熊果苷的生物合成

取胞內(nèi)粗酶液5 mL，加入反應物蔗糖和對苯二酚，于35 ℃、180 r·min-1下?lián)u床反應24 h。按下式計算對苯二酚的轉(zhuǎn)化率(x1)和選擇性(x2)：

式中：M1為加入到反應液中的對苯二酚的物質(zhì)的量；M2為反應消耗掉的對苯二酚的物質(zhì)的量；M3為對應生成α-熊果苷的對苯二酚的物質(zhì)的量。

1.4 α-熊果苷的檢測

取1 mL反應液，離心，取上清液，進行高效液相色譜檢測。

色譜條件如下：色譜柱為DiamonsilTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；紫外檢測器;柱溫25 ℃；流動相為 H2O-CH3OH(95∶5，體積比);流速1 mL·min-1；檢測波長280 nm;進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC譜圖

α-熊果苷標準品與反應液的HPLC圖譜見圖1。

由圖1可看出，反應液中出峰時間為9.306 min，與α-熊果苷標準品出峰時間(9.304 min)幾乎相同。這表明野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液能催化對苯二酚與蔗糖反應生成α-熊果苷。

2.2 反應條件的優(yōu)化

2.2.1 對苯二酚濃度對反應的影響(圖2)

圖2 對苯二酚濃度對反應的影響

由圖2可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨著對苯二酚濃度的增大先升高后降低；當對苯二酚濃度為40 mmol·L-1時，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達到最高。這可能是因為，對苯二酚濃度過高，抑制了葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性。因此，確定最佳對苯二酚濃度為40 mmol·L-1。

2.2.2 反應物摩爾比對反應的影響

理論上，對苯二酚與蔗糖合成α-熊果苷的反應中反應物摩爾比應該是1∶1，但該反應是一個可逆反應，根據(jù)反應動力學原理，增加一種反應物的量可以提高另一種反應物的轉(zhuǎn)化率。考慮到增加對苯二酚濃度會抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，所以本實驗通過增加蔗糖的量來提高對苯二酚的轉(zhuǎn)化率，從而提高α-熊果苷的產(chǎn)量。反應物摩爾比(對苯二酚與蔗糖摩爾比，下同)對反應的影響見圖3。

圖3 反應物摩爾比對反應的影響

由圖3可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨著反應物摩爾比的減小(即蔗糖用量的增加)先升高后降低；當反應物摩爾比為1∶30時，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達到最高。這可能是因為，當對苯二酚與蔗糖的摩爾比小于1∶30時，胞內(nèi)粗酶液中的其它酶競爭底物蔗糖進行其它的催化反應，從而使其對應生成α-熊果苷的量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均下降。因此，確定最佳反應物摩爾比(對苯二酚與蔗糖摩爾比)為1∶30。

2.2.3 緩沖溶液pH值對反應的影響(圖4)

圖4 緩沖溶液pH值對反應的影響

由圖4可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨pH值的增大先升高后降低；當pH值為7.0時，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達到最高。這是因為，pH值影響著酶的活性，酶在最適pH值下可以發(fā)揮最大的活性。在本催化反應中，pH值不僅影響葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，也影響底物對苯二酚的結(jié)構(gòu)變化，pH值為堿性時會導致對苯二酚的氧化，增強對葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，導致轉(zhuǎn)化率的降低。因此，確定最佳緩沖溶液pH值為7.0。

2.2.4 反應時間對反應的影響(圖5)

圖5 反應時間對反應的影響

由圖5可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨反應時間的延長先升高后降低；當反應時間為36 h時，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達到最高；隨著反應時間的繼續(xù)延長，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率都有所下降。這可能是因為，反應時間過長，粗酶液中的其它酶競爭底物蔗糖催化其它反應，降低了底物濃度，使蔗糖與對苯二酚合成α-熊果苷的反應逆向進行；同時對苯二酚濃度的提高也抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性。因此，確定最佳反應時間為36 h。

2.2.5 菌體濃度對反應的影響

理論上，出發(fā)菌體濃度越大，其所含的酶量也越多，即反應催化劑量越大，在其它反應條件不變的情況下，底物的轉(zhuǎn)化率也應該越大。菌體濃度對反應的影響見圖6。

圖6 菌體濃度對反應的影響

由圖6可知，隨著菌體濃度的增大，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率也明顯上升；當菌體濃度超過80 mg·mL-1時，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率上升幅度不明顯。因此，確定最佳菌體濃度為80 mg·mL-1。此時，α-熊果苷含量達到6.58 mg·mL-1、對苯二酚選擇性為66％、對苯二酚轉(zhuǎn)化率為91％。

3 結(jié)論

(1)確定野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004胞內(nèi)粗酶液生物催化合成α-熊果苷的最佳反應條件如下：反應溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1、對苯二酚濃度40 mmol·L-1、對苯二酚與蔗糖的摩爾比1∶30、緩沖溶液pH值7.0、反應時間36 h、菌體濃度80 mg·mL-1，在此條件下，α-熊果苷含量達到6.58 mg·mL-1、對苯二酚選擇性為66％、對苯二酚轉(zhuǎn)化率為91％。

(2)以蔗糖為供糖基底物，通過生物酶法催化合成α-熊果苷，與化學合成法相比，避免了原料成本高、合成路線長、工藝流程復雜、消耗大等缺點，在生產(chǎn)成本、對環(huán)境的影響、產(chǎn)品安全性方面均更具優(yōu)勢。

參考文獻：

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[7] 王秀捧，張淑榮，劉春巧，等.嗜麥芽黃單胞菌游離細胞催化合成α-熊果苷[J].微生物學通報，2007,34(3)：417-420.

[8] 劉春巧，張淑榮，張鵬.嗜麥芽黃單胞菌BT-112催化制備α-熊果苷[J].日用化學工業(yè)，2005，35(6)：364-367，383.