芒柄花黃素對超氧陰離子及羥自由基清除作用的研究＊

葉雨 陳健

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院急診科，廣西 南寧 530021；2.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣西 桂林 541004）

芒柄花黃素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是紅三葉草的主要活性成分之一，紅三葉草為豆科多年生牧草，原產(chǎn)于小亞細(xì)亞與東南歐，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)。我國廣西、云南、貴州有野生種。芒柄花黃素具有保護(hù)心血管，抗病毒，抗腫瘤等作用［1－4］。本研究組的前期研究表明，芒柄花黃素具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用［5］。本研究擬探討芒柄花黃素在體外對鄰苯三酚氧自由化產(chǎn)生的超氧陽離子自由基（）和由鄰二氮菲－Fe2＋／H2O2體系產(chǎn)生的羥自由基（·OH）的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑

芒柄花黃素（純度＞98%），購自天津馬克生物技術(shù)有限公司，溶解于二甲基亞砜配置成200M的儲存液，保存于4℃；H2O2，購自成都海興化工試劑廠；鄰苯三酚，購自成都市方舟化學(xué)試劑廠，分析純；鄰二氮菲，購自成都市方舟化學(xué)試劑廠，分析純；FeSO4，購自成都市方舟化學(xué)試劑廠，分析純。

1.1.2 溶液配制

PH 7.34的磷酸緩沖液（PBS）用磷酸二氫鉀和氫氧化鈉配制；PH 8.34的磷酸緩沖液（PBS）用磷酸二氫鉀和磷酸氫鉀配制。

1.1.3 儀器

Beckman DU640紫外分光光度計，723分光光度計。

1.2 方法

的方法［6，7］，采用如下實驗方法：總體積4.5ml的PBS（pH8.34）50mM，鄰苯三酚0.2mM，反應(yīng)溫度為25℃，加入一定量芒柄花黃素，測定反應(yīng)啟動后10s時的A322nm值（以同濃度芒柄花黃素作參比）。另取試劑同上，不加芒柄花黃素以作對照，測反應(yīng)啟動后第10s時的A322nm值（用pH 8.34的PBS作為參比）。清除率按下式計算：

反應(yīng)體系同上。用動態(tài)方法測定O2· －生成的反應(yīng)初速率V0（A.min－1）。反應(yīng)取得啟動后每30s測相應(yīng) A322nm值，至4.5min止。將所得A322nm值與時間t（min）進(jìn)行回歸分析，其斜率為V0。抑制率按下式計算：

1.2.3 ·OH的生成及清除率的測定

按參考文獻(xiàn)的方法［6，7］，采用如下實驗方法：鄰二氮菲0.35mmol·L－1，F(xiàn)eSO40.4mM，pH7.34的 PBS 150mM，加0.015%H2O2（損）或不加 H2O2（未損），37℃保溫90min，分別測510nm時的A值，得A損與A未損。鄰二氮菲0.35mM，F(xiàn)e－SO40.4mM，PBS（pH7.34）150mM，0.015%H2O2，加入一定量芒柄花黃素，各加藥管以加同濃度的芒柄花黃素作參比，測A510nm，即得A樣。·OH清除率按下式計算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

表1 芒柄花黃素對O2－的清除作用（，n＝10）

表1 芒柄花黃素對O2－的清除作用（，n＝10）

注：＊＊與對照組比較，P＜0.01。

組 別濃度（μg·ml－1）A322nm O－2清除率（%）對照組 －0.512±0.023芒柄花黃素 10 0.296±0.021＊＊ 42.1920 0.222±0.018＊＊ 56.6440 0.177±0.020＊＊65.43

用動態(tài)方法測得反應(yīng)的初速率V0（A.min－1）。本實驗回歸的相關(guān)系數(shù)在0.9968～0.9998之間。加入芒柄花黃素后，使得藥物在反應(yīng)體系里面的終濃度達(dá)到10、20、40μg·ml－1，生成速率V0顯著減小（結(jié)果見表2），表明芒柄花黃素能抑制的生成。

表2 芒柄花黃素對生成的作用（，n＝10）

表2 芒柄花黃素對生成的作用（，n＝10）

注：＊＊與對照組比較，P＜0.01。

組 別濃度（μg·ml－1）Vo（A·min－1）O－2抑制率（%）對照組 －0.161±0.016芒柄花黃素 10 0.111±0.008＊＊ 31.0620 0.089±0.010＊＊ 44.7240 0.059±0.014＊＊63.35

2.3 對·OH的作用

在本試驗條件下，按照上述計算公式，由A510nm的測定值觀察芒柄花黃素對·OH的清除作用。芒柄花黃素對·OH具有顯著的清除作用（結(jié)果見表3），其中以高劑量40μg·ml－1最為明顯。

表3 芒柄花黃素對·OH的作用（，n＝10）

表3 芒柄花黃素對·OH的作用（，n＝10）

注：＊＊與對照組比較，P＜0.01。

組 別 濃度（μg·ml－1） A510nm ·OH清除率（%）對照（受損） －0.513±0.0189對照（未損） － 1.302±0.028芒柄花黃素 10 0.789±0.021＊＊ 34.9820 0.837±0.019＊＊ 41.0640 0.999±0.017＊＊61.60

3 討論

我們采用體外實驗的方法研究芒柄花黃素對OFR的影響。在鄰苯三酚自氧化實驗中和有色中間產(chǎn)物生成，而該有色中間產(chǎn)物在322nm處有一特征吸收峰，本實驗利用這一特點(diǎn)間接測得生成情況及藥物對的清除率，同時，用動態(tài)方法測定生成反應(yīng)的初速度，還可觀察藥物對生成的抑制情況。結(jié)果表明，芒柄花黃素對具有明顯清除及抑制作用，并呈劑量依賴性。另一方面，我們通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，鄰二氮菲－Fe2＋被·OH氧化為鄰二氮菲－Fe3＋，其510nm處吸收峰消失，因此，測定此處吸收值的變化可以間接得知·OH的變化情況。當(dāng)加入芒柄花黃素后，體系的A值增大，表明芒柄花黃素對·OH的生成有抑制作用。聯(lián)系到我們前期研究成果芒柄花黃素能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，那么芒柄花黃素防治前列腺癌的作用是否與其清除氧自由基能力有關(guān)，機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1 Zhang S，Tang X，Tian J，et al.Cardioprotective effect of sulphona－ted formononetin on acute myocardial infarction in rats［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，108（6）：390－395.

2 Ha H，Lee HY，Lee JH，et al.Formononetin prevents ovariectomy－induced bone loss in rats［J］.Arch Pharm Res，2010，33（4）：625－632.

3 Huh JE，Kwon NH，Baek YH，et al.Formononetin promotes early fracture healing through stimulating angiogenesis by up－regulating VEGFR－2／Flk－1in a rat fracture model［J］.Int Immunopharmacol，2009，9（12）：1357－1365.

4 Chen J，Zeng J，Xin M，et al.Formononetin induces cell cycle arrest of human breast cancer cells via IGF1／PI3K／Akt pathways in vitro and in vivo［J］.Horm Metab Res，2011，43（10）：681－686.

5 Ye Y，Hou R，Chen J，et al.Formononetin－induced apoptosis of human prostate cancer cells through ERK1／2mitogen－activated protein kinase inactivation［J］.Horm Metab Res，2012Feb 10.［Epub ahead of print］

6 陳健，黃媛恒，王乃平，等.玉郎傘多糖和皂苷對氧自由基清除作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，5（5）：100－102.

7 于斐，孫曉萍，李建軍，等.光度法研究懷山藥清除羥自由基活性［J］.信陽師范學(xué)院學(xué)報，2006，19（2）：214－216.

8 Whaley－Connell A，McCullough PA，Sowers JR.The role of oxidative stress in the metabolic syndrome［J］.Rev Cardiovasc，2011，12（1）：21－29.

9 Fukai T，Ushio－Fukai M.Superoxide dismutases：role in redox signaling，vascular function，and diseases［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（6）：1583－1606.

10 Frstermann U.Nitric oxide and oxidative stress in vascular disease［J］.Pflugers Arch，2010，459（6）：923－939.

11 Liu J，Qu W，Kadiiska MB.Role of oxidative stress in cadmium toxicity and carcinogenesis［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，238（3）：209－214.

12 Lpez－L zaro M.Excessive superoxide anion generation plays a key role in carcinogenesis［J］.Int J Cancer，2007，120（6）：1378－1380.