葛根素通過ERK1／2信號通路促進內皮細胞增殖

唐哲明 梁國榮（廣西醫科大學第四附屬醫院（柳州市工人醫院）整形外科，廣西 柳州 545005）

葛根素系從豆科植物野葛或甘葛藤根中提取的一種黃酮苷。其化學名稱為：8－β－D－葡萄吡喃糖－4’，7－二羥基異黃酮。有擴張冠狀動脈和腦血管、降低心肌耗氧量，改善微循環和抗血小板聚集的作用［1－3］。已有研究表明，葛根素有促進內皮細胞增殖作用［4－9］，本研究以體外培養人臍靜脈內皮細胞HUVEC為模型，研究葛根素對HUVEC細胞增殖及凋亡的影響，并測定p－ERK1／2蛋白的表達，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

葛根素（HPLC＞98%）購于上海經科化學科技有限公司；四甲基噻唑蘭 （MTT）購于Invitrogen公司；磷酸化ERK1／2抗體及辣根過氧化酶標記二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞

人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC－12）培養于含10%胎牛血清、100U·ml－1青霉素和100μg·ml－1鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測細胞活性

取對數生長期HUVEC－12細胞經胰酶消化后，以2×104·孔－1的細胞密度接種于96孔板，每孔100μl。繼續培養24h待細胞完全貼壁后，移去上層培養液，加入含不同濃度葛根素（1、5、10、20、40、80、160μM）的新鮮培養基。空白對照組只加入培養基。繼續培養48h后，每孔加入MTT溶液（5mg·ml－1）20μl，孵育4h，吸去上清液，每孔加 DMSO 150 μl，避光振蕩10min，在全自動酶標儀上于490nm波長檢測各孔吸光度（OD）值。細胞增殖率＝處理組OD值／對照組OD值×100%。

1.3.2 流式細胞術

收集對數生長期細胞，調整細胞濃度，以每孔1×106個細胞接種到6孔板中。24h后，加入不同濃度葛根素（20、40、80 μM）及空白培養基，繼續培養48h后，胰蛋白酶消化收集各組細胞，1000rpm·min－1離心5min，加預冷的PBS洗滌2次后，Annexin V－FITC及碘化丙啶（PI，50μg·ml－1）室溫避光染色，15min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。總凋亡細胞率＝早期凋亡細胞率＋晚期凋亡細胞率。

1.3.3 Western Blot

收集對數生長期細胞接種于6孔板中。待細胞融合至90%，加入不同濃度葛根素（20、40、80μM）及空白培養基處理1h后，預冷PBS洗滌，加入蛋白裂解液置于冰上裂解30min后，4℃，12000rpm·min－1離心5min，取上清液。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃煮沸5min變性，行SDS－PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h。分別將膜置于p－ERK1／2及β－actin單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后，二抗室溫孵育2h，TBST漂洗3次，ECL顯色，暗室曝光并拍照。以β－actin為內參，用Quantity One軟件進行條帶分析。

1.4 統計學方法

用SPSS13.0版進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差表示，兩組間的顯著性差異采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 葛根素對HUVEC細胞增殖的影響

MTT結果顯示（圖1），經葛根素作用48h后，與空白對照組比較，80μM及以下各濃度組細胞增值率＞100%，且呈劑量依賴性。其中以20μM、40μM及80μM濃度時，促增殖作用最為明顯，增殖率分別達118.06%、135.92%及165.45%（P＜0.01）。隨葛根素濃度增加至160μM，細胞增殖受到抑制，增值率為95.1%。葛根素在較低濃度時能夠劑量依賴的促進HUVEC細胞增殖。

圖1 不同濃度葛根素對HUVEC細胞增殖的影響

2.2 葛根素抑制HUVEC細胞凋亡

經流式細胞術檢測凋亡率，如圖2所示，與空白對照組（14.23%）比較，經過不同濃度葛根素（20、40、80μM）處理48h后，各組細胞凋亡率分別減少到12.94%，9.63%，6.5%（P＜0.01）。

圖2 葛根素對HUVEC細胞凋亡的影響

2.3 葛根素誘導磷酸化ERK1／2蛋白的表達

為探討葛根素促進HUVEC細胞增殖的分子機制，本實驗采用Western Blot方法檢測經不同濃度葛根素處理1h后磷酸化ERK1／2蛋白表達水平的改變。與空白組相比，葛根素能劑量依賴性增加ERK1／2磷酸化水平（圖3），以40μM及80μM濃度尤為明顯（P＜0.01）。

圖3 葛根素對磷酸化ERK1／2蛋白水平的影響

3 討論

血管內皮細胞是血管內內循環介質與組織間隙的機械屏障，其分泌的多種細胞因子在燒傷早期炎癥反應中發揮重要作用。燒傷可造成血管內皮細胞受損、功能異常或凋亡，血管內皮機械屏障被破壞，加速炎癥反應［10－12］。因此研究藥物對內皮細胞增殖凋亡的影響，對于燒傷后組織的恢復具有重要意義。葛根素對HUVEC細胞有促進增殖的作用，并且減少HUVEC細胞早期凋亡率。

絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）是一組可被多種信號激活的絲／蘇氨酸激酶。經雙重磷酸化激活后可參與細胞的多種生物活性，如調節基因轉錄，誘導細胞凋亡、調節細胞周期等。ERK1／2信號通路是最早發現的經典的Ras－Raf－MAPK信號轉導途徑，在細胞分裂、遷移及存活。主要參與各種生長因子、細胞因子、絲裂原以及激素受體活化后的信號轉導，參與內皮細胞的生存、增殖［13－15］。我們的結果提示葛根素有激活磷酸化ERK1／2，呈劑量劑量依從性。因此葛根素誘導HUVEC細胞的增殖，抑制其早期凋亡主要是通過ERK1／2信號轉導通路實現的，考慮到葛根廣泛應用于臨床，本研究為其提供了理論依據。

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