多奈哌齊聯合維拉帕米對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的保護作用

廖玨 董雯

（1.瀘州醫學院基礎醫學院病原生物中心，四川 瀘州 646000；2.北京中醫藥大學東方學院臨床醫學系，河北 廊坊 065001）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年性癡呆的一種，多發生于中年或老年的早期，其發病率隨年齡增長不斷增高。目前，全球人口漸趨老齡化，AD的發病率將逐漸增高。AD涉及老年人的健康問題，帶來嚴峻的社會問題和經濟問題。因此，提高對AD的認識、重視，減少其發病，已迫在眉睫。關于AD其發病機制尚未明確，有文獻報道［1－2］：AD患者膽堿能神經受到損傷和細胞內鈣穩態失調。

多奈哌齊是近年來應用于臨床的一種新型可逆性膽堿酯酶抑制劑，而維拉帕米是一種作用于慢通道的鈣離子拮抗劑。本實驗通過Aβ1－40右側海馬區立體定向微量注射法制備大鼠AD模型，用多奈哌齊與維拉帕米進行干預，觀察藥物對AD模型大鼠記憶障礙、大鼠海馬系數比以及海馬的AChE活性，并行尼氏染色光鏡觀察海馬組織形態結構的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

腦立體定位儀及定位圖譜（美國 Myneurolab公司）；顱骨鉆；微量進樣器；722分光光度計；Aβ1－40（美國Sigma公司），無菌生理鹽水配置成2g·L－1溶液，置于37℃溫箱中孵育1w，使其變為具有神經毒性的凝聚狀態；多奈哌齊和維拉帕米由中國藥品生物制品檢定所提供；AChE測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 實驗動物與分組

清潔級健康成年雄性SD大鼠（重慶滕鑫生物科技有限公司）40只，體重250±30g。隨機分成4組，每組l0只，即假手術組、模型組、多奈哌齊組和聯合用藥組。

1.2 方法

1.2.1 AD大鼠模型的建立

參照《大鼠腦立體定位圖譜》［3］，選擇右側海馬區（前囟向后3.5mm，中線右旁2.8mm，硬腦膜下2.5mm）為注射靶區。用骨鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用10μ1微量進樣器自腦表面垂直進針2.5mm，以0.5μ1·min－1的速度均勻注入 Aβ1－40溶液5μ1，10min注射畢后，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口，于縫合處予滴0.1ml慶大霉素注射液，并用4萬U青霉素肌肉注射以抗感染，保暖至清醒，放回籠中常規飼養。假手術組以等量無菌生理鹽水代替Aβ1－40溶液，其余操作同上。所有操作均在相對無菌條件下進行。

1.2.2 給藥方法

假手術組、模型組：將蒸餾水按照大鼠體重8ml·kg－1灌胃，1 次 ·d－1；多 奈 哌 齊 組：大 鼠 多 奈 哌 齊 劑 量0.525mg·kg－1。將 制 備 的 多 奈 哌 齊 溶 液 給 予 一 次8ml·kg－1灌胃，1次·d－1；聯合用藥組：大鼠多奈哌齊劑量0.525mg·kg－1，維拉帕米劑量3mg·kg－1。將制備的多奈哌齊溶液和維拉帕米溶液混合給予一次8ml·kg－1灌胃，1次·d－1；每天上午10時灌胃給藥，持續4w。

1.2.3 Morris水迷宮實驗

灌胃4w后，采用Morris水迷宮對所有大鼠進行行為認知測試。在整個實驗中保持操作者位置及周圍環境的相對穩定。固定時問為每日9：00～16：00進行。Morris水迷宮［4］主要由圓形水池和自動錄像及分析系統組成。定位航行試驗：歷時5 d，每日分上、下午兩個時段，每個時段分別從4個不同的入水點，將大鼠面向池壁放人水中，記錄2min內尋找平臺所需總游泳路程（即逃避潛伏游程）。若大鼠人水后2min內未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留l0s。每次訓練問隔60s。

1.2.4 海馬系數測定

行為學測試結束后，每只動物稱重并處死，于冰浴中迅速取出腦組織，剝離出大腦皮層和海馬組織，并精確稱量海馬濕重。同時按照下列公式計算海馬系數：海馬系數（%）＝海馬濕重（g）／體重（g）×100%。

1.2.5 海馬組織中AChE活性的測定

乙酰膽堿酯酶（AChE）水解乙酰膽堿（ACh）生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應生成TNB（對稱三硝基苯，Sym－Trinitrobenzene）黃色化合物，根據顏色的深淺進行比色定量，水解產物膽堿的數量可反映膽堿酯酶的活力。取10%組織勻漿40μl，按試劑盒要求配試劑，混勻，靜置15min，于412nm處測各管OD值。組織勻漿中AChE活力（U·mg－1prot）＝（測定管OD值－對照管OD值）÷（標準管OD值－空白管OD值）×標準管濃度（1μmol·ml－1）÷蛋白含量（mg prot·ml－）。

1.2.6 尼氏染色

切片脫蠟，梯度酒精脫水后入蒸餾水。于預熱至60℃的1%甲苯胺藍30min后，以蒸餾水速洗，用95%酒精分色，鏡檢至神經元尼氏體清晰。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 定位航行能力變化

定位航行試驗，用于檢測動物在水迷宮的學習能力［4］。經過5d尋找隱藏平臺的定位航行訓練，從表1可知，同模型組比較，假手術組、多奈哌齊組和聯合用藥組逃避潛伏游程均縮短，具有統計學顯著性差異（P＜0.01）；同假手術組比較，多奈哌齊組和聯合用藥組逃避潛伏游程有所延長，但無統計學差異；多奈哌齊組與聯合用藥組之間逃避潛伏游程無統計學差異。

表1 逃避潛伏游程變化（m）（，n＝10）

表1 逃避潛伏游程變化（m）（，n＝10）

注：同模型組比較，＊＊P＜0.01。

組 別 逃避潛伏游程變化（m）Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 均 值假手術組 17.70±6.4516.66±4.4115.95±3.4213.72±5.1211.97±3.4015.20±2.32＊＊模型組 29.68±11.8123.12±8.2417.61±7.3017.15±8.6518.49±7.6121.21±5.30多奈哌齊組 19.92±8.5517.94±6.3614.79±6.6314.62±4.212.11±3.4015.88±3.06＊＊聯合用藥組 18.22±6.3716.81±5.5714.62±3.4714.31±3.0313.59±3.5315.51±1.93＊＊

2.2 海馬系數變化

從表2可見，同模型組比較，假手術組、多奈哌齊組和聯合用藥組具有統計學差異，其中假手術組和聯合用藥組具有統計學顯著性差異；模型組海馬系數顯著降低，多奈哌齊組、聯合用藥組海馬系數增加，提示藥物具有抗海馬萎縮的作用，其中聯合用藥效果更佳。

表2 海馬系數以及海馬組織AChE活性變化（，n＝10）

表2 海馬系數以及海馬組織AChE活性變化（，n＝10）

注：同模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 海馬系數（10－4） AChE活性（U·mg－1 prot）假手術組 7.63±1.38＊＊ 0.83±0.46＊＊模型組 5.40±0.66 3.08±1.50多奈哌齊組 7.17±1.21＊ 1.33±0.58＊聯合用藥組 7.30±2.00＊＊ 1.04±0.54＊＊

2.3 海馬組織AChE活性變化

從表2可見，同模型組比較，假手術組、多奈哌齊組和聯合用藥組海馬組織AChE活性減弱，具有統計學差異，其中假手術組和聯合用藥組具有統計學顯著性差異；同假手術組比較，多奈哌齊組和聯合用藥組海馬組織AChE活性有所增強，但無統計學差異；多奈哌齊組與聯合用藥組之間海馬組織AChE活性差異較小，無統計學差異。

2.4 海馬CA3神經元尼氏染色

假手術組海馬CA3區組織結構正常，無病理變化，偶見神經細胞損傷和尼氏體丟失。海馬錐體細胞排列整齊且緊密，胞漿染色清晰，尼氏體豐富。模型組海馬CA3區出現神經細胞變性壞死。海馬錐體細胞數目減少，結構模糊，胞體腫脹，排列散亂，并且胞漿內大面積的尼氏體丟失，尼氏體呈少而小，散在分布。多奈哌齊組與聯合用藥組海馬CA3區基本病變減輕，同模型組比較，錐體細胞排列較整齊，較緊密，胞漿內尼氏體較豐富，較清晰，見圖1。

圖1 海馬CA3神經元尼氏染色（×400）

3 討論

近年來，Aβ學說的推出為AD模型研究提供新的思路［4］。Aβ是AD大腦中老年斑的主要成分，是AD起始和進展的關鍵因子，是AD發病機制中的一個最重要環節［5］。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris在1981年設計并應用于研究大腦學習和記憶的裝置，能比較客觀的衡量動物的空間記憶，工作記憶以及空間辨別能力的改變［6］。定位航行實驗結果表明：模型組逃避潛伏游程較假手術組明顯延長，多奈哌齊組和聯合用藥組明顯短于模型組，說明模型組在實驗期間學習能力有所下降，多奈哌齊組和聯合用藥組學習能力明顯改善。逃避潛伏游程變化趨勢看，假手術組越來越短，符合學習越來越快特點，模型組逃避潛伏游程上下波動，多奈哌齊組和聯合用藥組變化趨勢不如假手術組，但是優于模型組，推測可能是注射Aβ1－40造成海馬損傷，導致學習過程不穩定，而多奈哌齊組和聯合用藥組相對于模型組有所改善。

本文結果表明，模型組海馬組織AChE活性升高，必然導致體內ACh水平下降。多奈哌齊組海馬組織AChE活性有下降趨勢，說明多奈哌齊作為可逆性中樞AChE抑制劑，具有較強的AChE抑制作用。本實驗中，造模藥物Aβ1－40可使AChE活性升高，加速Ach分解，破壞膽堿能神經傳導相關的信號通路，進而使膽堿能系統受損，導致認知功能障礙［7，8］。通過抑制AChE活性、增高Ach生物學作用，減輕Aβ1－40的沉積作用，加快Aβ1－40的代謝，有效阻止膽堿能神經元的繼續丟失，緩解AD患者記憶力下降和認知功能障礙的臨床癥狀。聯合用藥組的大鼠大腦海馬組織AChE活性有明顯下降趨勢，說明除多奈哌齊發揮AChE抑制作用外，維拉帕米也可減輕Aβ1－40對AChE活性的影響。體外實驗表明Aβ可形成一種跨膜的離子通道，能有效轉運Ca2＋，維拉帕米作為鈣離子抑制劑，可能抑制Aβ所致的Ca2＋內流，從而減輕Aβ所引起的膽堿能神經的損害。

尼氏染色主要用于觀察海馬CA3區錐體細胞的形態特點。尼氏體是神經細胞體內的嗜堿性的小體或細粒，正常狀態下神經元尼氏體都有比較固定的形態，是神經細胞存在的重要標志。當神經元受到損傷時，尼氏體會減少或脫失，因而尼氏體是反映神經元功能狀態的可靠探針［6］。本實驗采用甲苯胺藍尼氏染色法，可準確地顯示尼氏體，清晰顯示神經元及其尼氏體的形態。模型組海馬CA3區錐體細胞數量明顯減少，排列稀疏，細胞間隙明顯增大，細胞大面積丟失，殘存的細胞有大部分尼氏體變得模糊不清或消失。假手術組海馬CA3區錐體細胞胞漿內尼氏體豐富，細胞無丟失且排列整齊。多奈哌齊組和聯合用藥組海馬CA3區錐體細胞胞漿內尼氏體較豐富，細胞無明顯丟失，且排列較整齊。這些結果從組織學方面證實模型組具備的AD病理學特征。多奈哌齊和維拉帕米在一定程度上抑制Aβ1－40沉積，減少海馬錐體細胞丟失，細胞組織結構正常，學習記憶功能得以較好的維持。

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