哺乳動物卵母細胞退化機制＊

徐海琦 林輝榮 吳春麗 徐營（嘉興學院醫學院，浙江 嘉興 314001）

卵母細胞是哺乳動物體內最大的一種細胞，承載著繁衍后代的使命，而卵子的發育成熟是其完成生殖過程的先決條件。對卵泡的生長、發育和卵子成熟調控機制的研究一直是發育生物學的研究熱點之一。

卵母細胞來源于原始生殖細胞（Primordial germcells，PGC），胚胎發育期間，PGC進入生殖嵴不斷生長發育，在出生前后停滯在第一次減數分裂前期（即初級卵母細胞），直到性成熟才恢復減數分裂。初級卵母細胞被一層卵泡顆粒細胞包圍，構成原始卵泡。性成熟期，原始卵泡啟動發育，形成初級卵泡，進一步發育成次級卵泡及最后的成熟卵泡。成熟卵泡隨之破裂，發生排卵，此時的卵細胞為具有受精能力的成熟卵母細胞。卵泡發育期間，卵母細胞周圍的顆粒細胞也不斷增殖和分化［1］（如圖）。

圖1 卵母細胞與周圍體細胞的相互作用

1 卵母細胞的發育、成熟階段

這是一個非常復雜的動態過程，它主要由2方面的因素調控。一方面通過卵巢內微環境中的細胞因子調控，另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調控，即中樞神經內分泌進行調節。生長因子對卵母細胞成熟的作用是正向的。發育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時影響卵膜細胞和顆粒細胞的增殖和分化，并參與調節卵母細胞的成熟。卵巢內微環境局部的卵泡膜細胞、顆粒細胞以及卵母細胞等產生的自分泌和旁分泌調節因子，直接調控卵子的發育和成熟。研究表明，卵巢組織內合成分泌的白細胞介素（Interleukin，IL）［2］、胰島素樣生長因子－1（Insulin－like growth factor－1，IGF－1）［3］、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）［4］、轉化生長因子－β（Transforming growth factor－β，TGF－β）［5］、生長分化因子－9（Growth differentiation factor－9，GDF－9）、骨形態發生蛋白－15（bone morphogenetic protein－15，BMP－15）［6］、成熟促進因子（M－phase promoting factor，MPF）［7］等多種非激素類分子參與調節卵細胞的發育與成熟過程。近年來，隨著分子生物學的研究進展，圍繞絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路［8］、G蛋白耦聯受體介導的信號通路、受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase－Ras，RTK－Ras）信號通路、磷脂酰肌醇3－激酶（Phospho－inositide 3－kinases，PI3K）－蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或 Akt）信號通路、TGF－β信號通路、Wnt信號通路等在卵細胞發育成熟過程中的作用，也進行了較為系統的研究。

卵母細胞成熟抑制因子（OMI）是指卵泡液中能夠抑制卵母細胞成熟的物質。OMI是一個多肽，分子量約為1～2kDa，許多哺乳動物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母細胞體外培養中可阻止自發減數分裂成熟。目前研究較多的成熟抑制因子有環核苷酸和嘌呤。FST主要在卵巢的顆粒細胞中合成，而顆粒細胞又是與卵母細胞直接接觸的唯一的細胞，因此，FST在卵母細胞的成熟與退化過程上起著非常重要的作用。FST可以通過調節卵巢顆粒細胞的分化和成熟，并與活化相互作用，影響卵泡發育與閉鎖，繼而影響卵母細胞成熟過程［9］。

另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調控，即中樞神經內分泌進行調節。激素是促進卵母細胞成熟的重要物質，如促性腺激素、性激素及類固醇激素等［10－12］。激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質。目前，絕大多數研究者在卵母細胞的體外成熟培養過程中，添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物。但是，它們在卵母細胞體外成熟過程中的作用及作用機理尚未清楚。根據已有的研究結果推測，激素誘導卵母細胞恢復減數分裂可能通過2條途徑：①誘導卵丘擴散使顆粒細胞與卵母細胞的間隙連接中斷，使卵丘細胞的信息不能傳入卵母細胞，從而解除卵丘細胞對卵母細胞恢復減數分裂的抑制作用，重新啟動減數分裂。②誘導卵丘細胞產生一些刺激因子，克服抑制物質的作用而恢復減數分裂。現在，體外成熟培養中，主要以添加LH和hCG為主。Funashi等的研究表明，在豬卵母細胞體外成熟時，培養的前20h加入激素，培養20h后去掉激素，可增加卵母細胞體外成熟率，促進卵母細胞的減數分裂和細胞質成熟。同時指出，在豬卵母細胞體外成熟中，有兩個關鍵步驟是受激素調節的。一是核成熟，它可由培養的前20h加入激素所激發；二是細胞質成熟，在培養的后20 h去掉一部分或全部激素可以促進細胞質的成熟［13］。Delos－Reyes［14］等的研究也發現，在豬卵母細胞體外培養的第2階段去掉激素可以提高卵母細胞的體外成熟率。

有研究報道，豬卵母細胞的體外成熟伴隨卵丘細胞的擴散，擴散的卵丘細胞能夠調節諸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白質等物質在卵母細胞內外的進出，誘導卵母細胞排出有害因子，從而有效地抑制卵母細胞的退化［15－16］。卵母細胞在生長發育中所釋放的生長因子對卵丘細胞的生長也有一定的促進作用，卵母細胞與卵丘細胞的這種相互作用使得兩者共同發育生長，最終促進了卵母細胞的成熟。

2 卵母細胞退化機制

減數分裂紊亂以及細胞分裂基因的表達異常是人類以及其他高齡哺乳動物卵母細胞退化的主要機制之一。卵母細胞的減數分裂是由很多因子參與的精確、有序的調節過程，其中后期同源染色體／姐妹染色單體的分離對于維持基因組的完整性起重要作用，其分離缺陷會引起非整倍性，并導致出生缺陷。Hassold等研究認為卵母細胞的質量低下、數量下降，由減數分裂錯誤引起的卵母細胞質量下降是與衰老相關生育力下降的主要原因之一［17－19］，即發生了與年齡相關的卵母細胞退化。卵母細胞退化是衰老造成母源性生育力下降的主要因素。

Tarín的實驗表明，老化的卵母細胞受精產生的后代繁殖性能和壽命均下降［20］。可見，老化的卵母細胞對后代產生了嚴重負面影響。然而是什么機制導致了排卵后卵母細胞的老化，卵母細胞在老化過程中究竟發生了哪些變化是目前研究的熱點。

老齡動物的卵母細胞恢復減數分裂前在卵巢內停滯很長時間，這漫長的時間里，各種各樣內在和外源的因素可以引起紡錘體前體的降解和染色體損傷，其中與線粒體有關的氧化應激是一主要因素。Friedman等［21］報道隨年齡而增加，缺氧直接引起或再充氧后間接引起氧化應激產生。氧化應激損傷衰老期間的DNA和染色體及蛋白質，這些蛋白質可能涉及到對紡錘體組裝重要的微管和小分子。許多染色體相關或著絲粒相關的蛋白質，如Mps1、Mad2和Xkid，已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發揮重要作用［22］。總之，老齡個體減數分裂異常可能是許多因素損傷了紡錘體和染色體成分和／或改變了減數分裂各時期的時序，導致紡錘體紊亂和染色體排列異常。卵母細胞在遺傳學及生物學方面受到年齡的影響，其中由分裂錯誤所導致的非整倍性增加和染色單體早現被認為與衰老相關卵母細胞質量下降方面起有主要作用。在人，卵母細胞和胚胎非整倍性的比率隨母體年齡增長而顯著增加［23］，Eichenlaub－Ritter［24］統計了4000多個老齡人的 MⅡ期卵母細胞，其中8.6%為超倍性，13.5%為低倍性，因此保守的估計（非整倍性相當于2倍超倍體的水平）有17.2%的卵母細胞染色體異常，在估計整個非整倍性水平時若也算上低倍性則有20%以上的卵母細胞染色體異常。考慮到MⅡ期卵母細胞的非整倍性僅反映了第一次減數分裂錯誤的程度，完成第二次減數分裂后非整倍性的比率在老齡個體會更高。Eichenlaub－Ritter等［25］報道老齡小鼠MⅡ期卵母細胞染色體數異常的比例顯著高于年輕小鼠，同時高比例（P＜0.001）的老齡小鼠卵母細胞在 MⅡ期含一條或幾條染色單體。

現在發現了許多與卵母細胞退化相關的基因。這些基因包括 GDF29、Fac、AtrPAtm、Mlh1、Zfx、ER、Cyclin D2、Connexin 37、bcl－2、ob、c－mos、p27〔kip1〕、C／ERPbeta、Hook等，它們的特征表現為以下幾個方面：①影響卵巢發育及卵泡成熟，如p27〔Kip1〕、c－mos，敲除這些基因將導致排卵數的下降，但有關的調控機理目前尚不清楚；②調控細胞周期并影響卵母細胞的減數分裂，如AtrPAtm，它們分別定位于減數分裂中聯會與非聯會的染色體上，將它們敲除會導致偶線期P粗線期的阻滯。而缺少c－mos的卵母細胞則會產生異常的紡錘體及錯誤的染色體濃縮，最終導致卵母細胞MⅡ期阻滯的失敗，激活孤雌生殖；③對激素調控起作用，如ER等；④與染色體分離和微管骨架有關。Hamatani等［26］研究發現隨著母親年齡增大，Cggbp1等與染色體分離及微管骨架有關的基因轉錄下降。

通過對酵母的研究發現，粘著蛋白（Cohesin）可以調節染色體的正確分離，姐妹染色單體是靠粘著蛋白形成的粘著力緊密的連在一起，在S期與姐妹染色單體結合，在中期向后期過度時從染色體上解離的。2001年Dobie等人研究發現了wapl基因與染色體的分離有關，但具體機制并不是很清楚。突變的wapl基因在異染色質區域阻止了姐妹染色單體的正常靠近和并列，但是不影響染色體的凝集和分離。wapl基因在有絲分裂的異染色質區域對于維持姐妹染色單體的粘連起著非常重要的作用，具有調節染色體遺傳的功能。在293T細胞wapl的過表達使細胞早熟姐妹染色單體分離頻率增高，引起非整倍的產生。wapl缺失后細胞就短暫的停滯在前中期，姐妹染色單體分離率下降，并在后期出現多分裂核現象，同時粘著蛋白表達量也增加。許多染色體相關或著絲粒相關的蛋白質，如 Mps1、Mad2已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發揮重要作用。而在卵母細胞成熟發育過程中，染色體的分離依賴于紡錘體，若紡錘體出現異常，細胞分裂就不能正常完成，從而卵子就不能進行正常受精、卵裂。

減數分裂異常是卵母細胞退化的一種顯著特征。低質量的卵母細胞影響減數分裂中染色體的分離，導致胚胎在附植前后丟失或產生三倍體，進而影響人類及其他哺乳動物的生育。有證據表明老齡動物卵母細胞在第二次減數分裂時也出現異常。Liu等發現MⅡ期結束時非整倍體的比率在老齡鼠中明顯升高，這表明染色體的錯誤分離在減數分裂期也有發生，而且確實與母親年齡相關。此外，Battaglia與Volarcik等發現，與年輕女性的卵母細胞相比，中老年婦女的MⅡ期卵母細胞紡錘體更松散，而且染色體與紡錘體在不同的位點無規則地相連。

3 展望

綜合以上所述，衰老導致的哺乳動物卵母細胞發育成熟過程及體外老化過程中所發生的變化，尤其是細胞分裂（減數分裂）相關分子表達變化的研究方面還處于起步階段，存在諸多的未知未明之處，有待于進行進一步的研究。

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