姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

龔 淼，李 莉，包憲霞，孟 麗，張亞楠，郭淺妤，趙 昱，張 雷*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050017；2.石家莊市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織學(xué)與

胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)中心，河北石家莊 050017）

·論 著·

姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

龔 淼1，李 莉1，包憲霞2，孟 麗3，張亞楠1，郭淺妤1，趙 昱1，張 雷1*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050017；2.石家莊市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織學(xué)與

胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)中心，河北石家莊 050017）

目的研究姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法采用噻唑蘭（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)不同濃度姜黃素對(duì)人食管癌Ec-109細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ec-109細(xì)胞的凋亡情況；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Fas、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果姜黃素可顯著抑制Ec-109細(xì)胞的增殖，呈劑量和時(shí)間依賴性，半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentraltion 50，IC50）為22.09μmol/L（姜黃素濃度為80μmol/L作用60h）。不同濃度姜黃素均可誘導(dǎo)Ec-109細(xì)胞凋亡。姜黃素可顯著下調(diào)Ec-109細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，顯著上調(diào)Fas蛋白表達(dá)。結(jié)論姜黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

姜黃素；食管腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

姜黃素是從姜科植物的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等廣泛的藥理作用［1］。近年來有研究［2］發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗消化系統(tǒng)腫瘤中有顯著作用，但其對(duì)低分化食管癌細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。本研究擬探討姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和藥物：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；噻唑蘭（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）；熒光染料（Sigma公司，美國(guó)）；兔抗人Fas抗體、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體和SP試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）。姜黃素（Sigma公司，美國(guó)），實(shí)驗(yàn)前用1mL二甲基亞砜充分溶解，用RPMI1640培養(yǎng)液配成終濃度為80μmol/L的母液，后稀釋至所需濃度。

1.1.2 細(xì)胞株：人食管癌Ec-109細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所建系，本實(shí)驗(yàn)室凍存。接種細(xì)胞于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測(cè)定姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec-109細(xì)胞和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200μL單細(xì)胞懸液，使每孔含量1.4×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種6個(gè)96孔板，常規(guī)培養(yǎng)16h后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為20、40和80μmol/L姜黃素，陰性對(duì)照組加入等體積完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為比色時(shí)調(diào)零用。分別在常規(guī)培養(yǎng)20、40和60 h后取出2個(gè)培養(yǎng)板每孔滴加MTT溶液（5g/L）20μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育4h后終止培養(yǎng)。去除孔內(nèi)上清液，每孔滴加DMSO 200μL，振蕩15min。用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定各孔吸光度（A值），記錄結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式，增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞凋亡的影響：取12瓶對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ec-109細(xì)胞，不同濃度（0、20、40和80μmol/L）姜黃素分別作用20、40和60h。每隔20h取出不同藥物濃度細(xì)胞4瓶，收集細(xì)胞分別放入4個(gè)離心管內(nèi)標(biāo)記后進(jìn)行離心，制成細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L的單細(xì)胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預(yù)冷70%無水乙醇7m L，4℃過夜。采用PI單染法，以10%雞紅細(xì)胞作內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，每份樣品中加入1mL PI染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氬離子激光器激發(fā)由帶630nm帶通濾光片接收，通過散點(diǎn)圖收集10 000個(gè)細(xì)胞，分析PI熒光直方圖上凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定Fas、PCNA蛋白的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成濃度為1×108個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，接種到放有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)箱孵育24h，使細(xì)胞貼壁于蓋玻片上。24h后取出6孔板去上清液分別給予藥物終濃度為0、20、40、80 μmol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)20、40和60h后分別取出蓋玻片。SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，3%甲醇-H2O2室溫處理10min，微波抗原修復(fù)（9℃）15min。免疫細(xì)胞化學(xué)法染色。用己知陽性切片作陽性對(duì)照，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，測(cè)定特異性著色的平均積分光密度值來分析相應(yīng)指標(biāo)的蛋白表達(dá)的水平，平均積分光密度值越高，其表達(dá)越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)（q檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞增殖的影響：MTT結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞有明顯生長(zhǎng)抑制作用（P＜0.05），當(dāng)80μmol/L姜黃素處理Ec-109細(xì)胞60h后，其增殖抑制率達(dá)到85.7%，顯示出較強(qiáng)的增殖抑制作用。姜黃素作用20h的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentraltion 50，IC50）為113.28μmol/L（P＜0.05），作用40h的IC50為13.28 mg/L（P＜0.05），作用60h的IC50為8.13mg/L（P＜0.05）。細(xì)胞增殖抑制率隨姜黃素濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，具有濃度的時(shí)間依賴性。見表1。

表1 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞增殖抑制率的影響Table 1 Effects of Curcum in on the proliferation of Ec-109 cells

2.2 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素溶液對(duì)Ec-109細(xì)胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，細(xì)胞凋亡率隨姜黃素濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，具有濃度和時(shí)間依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞凋亡率的影響Table 2 Effect of curcum in on the apoptosis of Ec-109 cells

圖1 PCNA在陰性對(duì)照組Ec-109細(xì)胞中的陽性表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)法×200）Figure 1 Positive expression of PCNA in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

圖2 PCNA在經(jīng)80μmol/L姜黃素作用40h后的Ec-109細(xì)胞中的弱陽性表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)法×200）Figure 2 Weak positive expression of PCNA in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

2.3 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞Fas、PCNA蛋白表達(dá)的影響：Fas蛋白陽性表達(dá)部位為細(xì)胞膜，PCNA蛋白陽性表達(dá)部位為細(xì)胞核。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，PCNA蛋白在姜黃素作用組表達(dá)明顯下調(diào)，在陰性對(duì)照組呈強(qiáng)陽性表達(dá)，F(xiàn)as蛋白在姜黃素作用組表達(dá)明顯上調(diào)，在陰性對(duì)照組呈陰性表達(dá)，見表3、4，圖1～4。

表3 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effects of curcum in on the expression of PCNA protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

表4 姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的影響Table4 Effects of curcum in on the expression of Fas protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

圖3 Fas在陰性對(duì)照組Ec-109細(xì)胞中的陰性表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)法×200）Figure 3 Negative expression of Fas in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

圖4 Fas在經(jīng)80μmol/L姜黃素作用40h后的Ec-109細(xì)胞中的陽性表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)法×200）Figure 4 Positive expression of Fas in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究了姜黃素對(duì)人食管癌Ec-109細(xì)胞株的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要特征就是腫瘤細(xì)胞可以持續(xù)分裂并不斷增殖［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素對(duì)Ec-109細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并呈劑量與時(shí)間依賴性，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，80μmol/L濃度姜黃素組對(duì)Ec-109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用大于20μmol/L濃度組，姜黃素溶液在80μmol/L濃度下作用60h對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用最明顯，IC50為8.13mg/L。

細(xì)胞凋亡是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程［4］。凋亡細(xì)胞的DNA分子發(fā)生斷裂，分子量小的DNA片段穿過細(xì)胞膜丟失，分子量大的片段形成一個(gè)DNA含量小于二倍體的區(qū)域，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中形成位于G0/G1峰之前的亞G1峰，由于壞死的細(xì)胞檢測(cè)不出現(xiàn)此峰，故此峰被稱作凋亡峰［5］，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細(xì)胞的數(shù)量成正比，本研究結(jié)果顯示，姜黃素可以誘導(dǎo)Ec-109細(xì)胞凋亡，并有量效和時(shí)效依賴關(guān)系，此結(jié)果與前面MTT和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期相一致。

綜上所述，姜黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

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（本文編輯：劉斯靜）

EFFECTSOF CURCUM IN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSISOF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA Ec-109 CELLS IN VITRO

GONG Miao1，LILi1，BAO Xianxia2，MENG Li3，ZHANG Yanan1，GUO Qianyu1，ZHAO Yu1，ZHANG Lei1*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Histology and Embryology，Shijiazhuang Medical College，
Shijiazhuang 050000，China；3.Laboratory Center of Electron Microscopy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effects of curcumin on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 109（Ec-109）cell line in vitro.MethodsThe inhibitory effect of curcumin on the proliferation of human Ec-109 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.The changes of cellapoptosis rate of tumor cellswere determined by flow cytometry（FCM）.The expressions of Fas and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）proteins were examined by immunocytochemical technique.ResultsCurcumin significantly inhibited the proliferation of Ec-109 cells in a dose-and time-dependentmanner，with the inhibitory concentraltion 50（IC50）of22.09μmol/L（Curcumin concentration for 80μmol/L role of 60h）.Different concentrations of curcumin can induce apoptosis of Ec-109 cell.Curcumin dramatically inhibited protein expression of PCNA，while upregulated the expression of Fas protein.ConclusionCurcumin can inhibit theproliferation of Ec-109 cells and induce the apoptosis of Ec-109 cells in vitro.

curcumin；esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis

R329.28

A

1007-3205（2012）02-0125-04

2011-12-05；

2012-01-27

河北省科技廳計(jì)劃指導(dǎo)課題（10276181）

龔淼（1983-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院助教，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事組織學(xué)與胚胎學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.001