基質金屬蛋白酶-9在人腦膠質瘤中的表達及意義

王 毅，劉志紅，焦保華，陳永漢，張 剛

（1.河北省滄州市中心醫院神經外二科，河北滄州 061000；2.河北醫科大學第二醫院內分泌科，

河北石家莊 050000；3.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

基質金屬蛋白酶-9在人腦膠質瘤中的表達及意義

王 毅1，劉志紅2，焦保華3，陳永漢1，張 剛1

（1.河北省滄州市中心醫院神經外二科，河北滄州 061000；2.河北醫科大學第二醫院內分泌科，

河北石家莊 050000；3.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

目的探討基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）與腦膠質瘤發生發展的關系。方法以52例人腦膠質瘤組織標本作為研究對象，采用免疫組織化學方法檢測MMP-9的表達，并應用原位雜交技術檢測MMP-9 mRNA在人腦膠質瘤中的表達情況。結果MMP-9、MMP-9 mRNA的表達水平與腫瘤的分級呈正相關（r=0.925，P均＜0.01）。結論MMP-9在腦膠質瘤發生發展中具有重要作用，MMP-9可能與判斷預后有關。

基質金屬蛋白酶類；神經膠質瘤；免疫組織化學

惡性腦膠質瘤的主要特征是向周圍正常組織浸潤和轉移。這一特征使得惡性腦膠質瘤的手術全切和局部治療困難，同時也是腫瘤術后復發和（或）再發的主要原因之一。因此，了解腫瘤細胞的浸潤和轉移機制十分必要。研究發現，這一過程涉及腫瘤細胞黏附、基質降解、細胞遷移等許多環節。細胞外基質在腫瘤的浸潤和侵襲過程中起著關鍵作用。而細胞外基質的降解主要是依靠蛋白水解酶。基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中較為重要的一類，它們通過對ECM的降解促進腫瘤細胞向周圍組織侵襲。本研究采用免疫組織化學和原位雜交技術，檢測MMP-9和MMP-9 mRNA在52例人腦膠質瘤中的表達，以探討其活性與腦膠質瘤侵襲性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：我院神經外科2008年3月—2010年5月手術切除且保存完好的膠質瘤組織石蠟包埋標本52例，臨床資料完整，男性28例，女性24例，年齡7～78歲，平均42.7歲。腦膠質瘤組織學分型根據2000年修改的WHO神經系統腫瘤分級標準對其進行分類分級，其中Ⅰ～Ⅱ級（星形細胞瘤）25例，Ⅲ級（間變性星形細胞瘤）17例，Ⅳ級（多形性膠質母細胞瘤）10例，所有患者術前均未進行放療與化療。

1.2 組織標本的制備：取手術中切除的新鮮腦膠質瘤樣本，去除血凝塊、壞死及電灼組織，用生理鹽水沖洗后迅速置于4%多聚甲醛中固定，2h后常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋。連續切片5～6張，厚度4μm，用涂有APES載玻片貼片，60℃烘烤72h，行免疫組織化學染色和原位雜交。

1.3 試劑與方法：MMP-9單克隆抗體由武漢博士德公司提供，PV6001二抗試劑盒及濃縮型DAB試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供，原位雜交試劑盒由武漢博士德公司提供。采用免疫組織化學PV法檢測基質金屬蛋白酶-9在腦膜瘤中的表達，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。采用原位雜交方法檢測MMP-9 mRNA的表達，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 陽性結果判定：MMP-9免疫組織化學染色位于細胞胞漿，極少數有胞核著色，光鏡下呈棕黃色或棕褐色，在400倍光鏡下至少觀察5個視野，腫瘤陽性細胞≥5%為陽性表達，＜5%為陰性表達。MMP-9 mRNA原位雜交細胞胞漿著色呈棕黃色為陽性。以高倍視野（×400）下陽性細胞數量綜合判斷，采用半定量分析法。每張切片隨機選擇5個以上高倍視野，鏡下視野清晰，無壞死、出血，計算1 000個腫瘤細胞的陽性率。每張切片計數1 000個腫瘤細胞，求出蛋白表達陽性細胞百分數，用標記指數（labeling index，LI）表示，LI=陽性細胞數/計數細胞數×100%；mRNA表達陽性細胞百分數也用LI表示。

圖1 MMP-9在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤中的表達（免疫組織化學pv法×400）Figure 1 Expression ofMMP-9 in gradeⅠ～Ⅱglioma（IHC×400）

1.5 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析并作兩兩比較的q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MMP-9在腦膠質瘤中的表達結果：MMP-9免疫組織化學陽性染色在胞核和胞漿中均有表達，但以胞漿著色為主，陽性細胞胞漿呈棕黃色或棕褐色（圖1～3）。低級別組（Ⅰ～Ⅱ級）膠質瘤中MMP-9的LI是0.114 3±0.020 7；Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中MMP-9的LI分別是0.230 5±0.124 7、0.358 2±0.115 3。MMP-9的表達在膠質瘤各級間差異有統計學意義（P＜0.01）。MMP-9蛋白與膠質瘤病理分級呈顯示正相關（r=0.925，P＜0.01），隨膠質瘤級別增高，MMP-9蛋白陽性表達升高。

圖2 MMP-9在Ⅲ級膠質瘤中的表達（免疫組織化學pv法×400）Figure 2 Expression ofMMP-9 in gradeⅢglioma（IHC×400）

圖3 MMP-9在Ⅳ級膠質瘤中的表達（免疫組織化學pv法×400）Figure 3 Expression of MMP-9 in gradeⅣglioma（IHC×400）

2.2 腦膠質瘤中MMP-9 mRNA表達情況：MMP -9 mRNA原位雜交呈棕黃色顆粒或棕褐色顆粒，著色于胞漿中及少量胞核中，呈棕黃色（圖4～6）。MMP-9 mRNA表達與MMP-9表達檢測結果基本一致。腫瘤組織中可見MMP-9 mRNA陽性染色。低級別組（Ⅰ～Ⅱ級）膠質瘤中MMP-9 mRNA的RI是0.1035±0.0207；Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中MMP-9 mRNA的LI分別是0.2012±0.1084、0.4017± 0.1153。MMP-9 mRNA在膠質瘤各組陽性表達率明顯高于正常腦組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）；膠質瘤各級間差異均有統計學意義（P＜0.01）。MMP-9 mRNA與膠質瘤病理分級存在顯著正相關性（r=0.938，P＜0.01），隨膠質瘤級別增高，MMP-9 mRNA陽性表達升高。

圖4 MMP-9 mRNA在Ⅰ-Ⅱ級膠質瘤中的表達（原位雜交法×400）Figure4 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅠ～Ⅱglioma（in situ hybridization×400）

圖5 MMP-9 mRNA在Ⅲ級膠質瘤中的表達（原位雜交法×400）Figure5 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅢglioma（in situ hybridization×400）

圖6 MMP-9 mRNA在Ⅳ級膠質瘤中的表達（原位雜交法×400）Figure6 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅣglioma（in situ hybridization×400）

3 討 論

人腦膠質瘤的生物學行為和腫瘤細胞的侵襲情況密切相關。膠質瘤浸潤和轉移包括3個步驟，腫瘤細胞黏附到細胞外基質，并與在基底膜表面分布的整合素受體及非整合素受體相結合；腫瘤細胞所分泌的蛋白水解酶降解、破壞由細胞間基質和基底膜組成的細胞外基質；伸出偽足的腫瘤細胞向已被蛋白水解酶降解的基質區域運動。MMPs一方面通過降解破壞基底膜和包繞腫瘤的基質，突破基質屏障，促進腫瘤侵襲轉移；另一方面通過促進新生血管的形成從而參與腫瘤的生長和侵襲。

MMPs系統一類Zn2+依賴多基因內肽酶家族。MMPs主要由氨基端的信號肽和前肽部分，中間的催化活性區域和羧基末端區域構成。目前普遍認為，MMPs涉及與惡性腫瘤相關的多個過程，包括腫瘤侵襲、轉移、血管生成及腫瘤細胞的增殖。膠質瘤的侵襲性與其MMPs的表達與活化有密切的關系。在檢測瘤組織中MMPs水平時發現，過表達的MMP -9與腦膠質細胞瘤的病理分級、惡性進展、患者預后等因素直接相關［1］。應用Northern blotting和免疫組織化學技術對臨床組織標本檢測表明，膠質細胞瘤中存在MMP-9的轉錄和表達，并隨膠質瘤惡性程度的增高，其轉錄和表達水平亦明顯增加。膠質細胞瘤中同樣觀察到細胞因子和生長因子對MMPs基因的表達和蛋白分泌的調節作用。這些因子有白細胞介素-21、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β、白細胞介素-1，腫瘤壞死因子-α誘導MMP-9的表達和分泌，TGFβ則以劑量依賴方式抑制白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α誘導的MMP -9轉錄和表達。MMP-9作用于基膜，使細胞外基質和基底膜降解，從而血管內皮細胞出芽形成新生血管，加速腫瘤細胞生長和侵襲［2］，MMP-9是血管發生啟動系統中的成員，能夠上調腫瘤血管化［3］，在腫瘤的侵襲轉移中發揮作用。血管形成是惡性腫瘤侵襲轉移的一個重要環節，研究發現［4］，高級別膠質瘤微血管密度（microvessel density，MVD）表達顯著高于低級別膠質瘤（P＜0.01），MVD的表達與膠質瘤的病理分級呈正相關，MMP-9與腫瘤MVD表達強度情況相關，隨著MMP-9表達增高，MVD也逐漸增加，其血管形成趨向活躍，提示了在膠質瘤血管形成中MMP-9可能具有正向調節作用。血管形成是膠質瘤侵襲和生長的必要條件之一，新形成的血管造成的裂隙為腫瘤細胞向外侵入周圍正常組織開啟了道路，MMP-9既可以降解細胞外基質和基底膜，使之從腫瘤鄰近組織遷徙到腫瘤組織，又可以與一些血管生長調節因子協同作用最終參與腫瘤組織新生血管形成。Rooprai等［5］發現膠質瘤的瘤細胞和腫瘤的血管基底膜及內皮細胞均有MMP-9的表達，其表達隨著膠質瘤病理級別的增高而增強。

本結果與上述報道結果相似，說明在腦膠質瘤中MMP-9表達增高，且與腫瘤的惡性程度呈正相關。MMP-9與腫瘤的侵襲性有密切關系，可以促進腫瘤的生長和發展。提示MMP-9可以作為判斷腫瘤預后的一個重要指標。

［1］ 張軍普，許雯，劉向輝.PTEN、E-cd和MMP-9在人腦膠質瘤的表達和意義［J］.山東大學學報，2010，48（2）：109-112.

［2］ 李樹合，周定標，余新光，等.膠質母細胞瘤中MMPs和TMPs的表達及其與瘤周水腫的相關性分析［J］.軍醫進修學院學報，2006，27（3）：214-215.

［3］ SEANDEL M，NOACK-KUNNMANN K，ZHU D，et a1.Growth factor-induced a-ngiogenesis in vivo requires specifc cleavageof fibrillar type I collagen［J］.Blood，2001，97（8）：2323-2332.

［4］ 孫榮輝，徐國政.VEGF、MMP-9在人腦膠質瘤中的表達及其意義［J］.中國臨床神經外科雜志，2010，15（5）：273-277.

［5］ ROOPRAIHK，RNCKLIDGE GJ，PANOU C，et al.The effects of exogenous growth factors on matrix metalloproteinase secretion by human brain tumor cell［J］.Br JCancer，2000，82（1）：52-55.

（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION OF MMP-9 IN HUMAN GLIOMA AND THEIR SIGNIFICANCE IN THE PATHOGENESIS

WANG Yi1，LIU Zhihong2，JIAO Baohua3，CHEN Yonghan1，ZHANG Gang1
（1.Department of Neurosurgery，Cangzhou Central Hospital，Hebei Province，Cangzhou 061000，China；2.Department of
Endocrinology，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the relationship between the matrix metalloproteinases-9（MMP-9）and the pathogenesis of brain glioma.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-9 in 52 cases of brain glioma，MMP-9 mRNA was detected in brain glioma by in situ hybridization.ResultsThe expression of MMP-9 was positively correlated with tumor classification（P＜0.01）.There was positive correlation between MMP-9 mRNA and tumor classification（P＜0.01）.ConclusionMMP-9 may be involved in the development of brain glioma. MMP-9 is a prognostic indicator in brain glioma.

matrixmetalloproteinases；glioma；immunohistochemistry

R739.4

A

1007-3205（2012）02-0147-04

2011-09-30；

2011-12-23

王毅（1980-），男，山東冠縣人，河北省滄州市中心醫院主治醫師，醫學碩士，從事神經外科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.009