胰島素抵抗心肌細胞模型的建立與評價

王 梅，李擁軍，劉素云，張 輝，楊 蓉，苗成龍

（河北醫科大學第二醫院心血管內四科，河北石家莊 050000）

·論 著·

胰島素抵抗心肌細胞模型的建立與評價

王 梅，李擁軍*，劉素云，張 輝，楊 蓉，苗成龍

（河北醫科大學第二醫院心血管內四科，河北石家莊 050000）

目的建立胰島素抵抗心肌細胞模型。方法原代培養2～3d SD大鼠心肌細胞分為對照組、葡萄糖組（glucose，G）、胰島素組（insulin，Ins）、葡萄糖+胰島素組（G+Ins）。在干預24h和48h后評價細胞的胰島素敏感性，檢測脂聯素表達。結果干預48h后，Ins組、G+Ins組心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率分別為（12.46±1.11）nmol·mg-1·h-1、（10.61±1.14）nmol·mg-1·h-1，均較對照組的（14.06±0.43）nmol·mg-1·h-1顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。干預48h后，Ins組、G+Ins組心肌細胞脂聯素mRNA表達分別為0.35±0.04、0.38±0.04，均較對照組的0.77±0.08顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組、G組、Ins組、G+Ins組3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細胞脂聯素mRNA表達量均呈顯著正相關（r=0.92、0.82、0.89、0.86，P均＜0.05）。結論應用高胰島素誘導法、高葡萄糖+高胰島素共同誘導法均可建立胰島素抵抗心肌細胞模型；胰島素抵抗下調心肌細胞脂聯素表達水平；胰島素抵抗心肌細胞脂聯素表達水平與胰島素抵抗呈正相關。

肌細胞，心臟；胰島素；模型，動物

胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖、高血壓等多種疾病的共同病理生理學基礎，其代表性特征是高胰島素血癥、高血糖和內環境紊亂。建立相應的模型系統有利于在細胞及分子水平深入研究胰島素抵抗的發生機制。目前，較為成熟的胰島素抵抗體外細胞模型主要有地塞米松誘導模型、游離脂肪酸誘導模型、腫瘤壞死因子誘導模型等，但均局限在脂肪細胞、肝細胞、骨骼肌細胞，針對心肌細胞的胰島素抵抗細胞模型國內外未見報道。本研究應用高葡萄糖、高胰島素、高葡萄糖加高胰島素法誘導建立胰島素抵抗心肌細胞模型，旨在為進一步研究心肌細胞胰島素抵抗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：2～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠（河北醫科大學實驗動物中心提供）32只。

1.2 藥品與試劑：DMEM低糖培養液、D-Hanks、Ⅱ型膠原酶干粉、Trizol均為GIBCO公司產品；胰蛋白酶干粉為Hyclone產品；新生牛血清、D-甘露醇、牛胰島素、多聚甲醛為 Sigma公司產品；雙抗為Invitrogen產品；BrdU為Boster產品；多聚賴氨酸為Amresco產品；APN抗體為Abcam產品；PCR擴增試劑為Promega產品；RT-PCR檢測試劑盒為大連寶生工程有限公司產品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖為北方同正產品；其他試劑均為分析純?；旌厦赶号渲梅椒ǎ鹊鞍酌父煞?.08g，Ⅱ型膠原酶干粉0.032g，加入37℃預熱的D-Hanks液至80mL，勻，過濾除菌，即用即配。

1.3 心肌細胞培養：取新生2～3d的SD大鼠，在無菌的條件下，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1mm3大小的碎塊，加入混合酶消化液，取消化完畢后的上清液，200目細胞網篩過濾，所得細胞懸液差速貼壁后以1×106/mL的密度接種于6孔板，加入5-溴脫尿苷0.1 mmol/L，在二氧化碳孵育箱內以含10%血清的低糖DMEM培養基培養。

1.4 實驗分組：常規進行心肌細胞原代培養48h后，換為無血清的低糖DMEM培養基培養24h，之后分為4組，每組8只。①對照組（control），以低糖DMEM培養基培養。②葡萄糖組（glucose，G），以30mmol/L葡萄糖干預。③胰島素組（insulin，Ins），以10-7mmol/L胰島素干預。④葡萄糖+胰島素組（G+Ins），以30mmol/L葡萄糖和10-7mmol/L胰島素共同干預。

1.5 胰島素抵抗心肌細胞模型的鑒定：采用3HD-葡萄糖摻入實驗評價細胞的胰島素敏感性。上述各組心肌細胞根據干預時間不同再分為24h組（干預24h）和48h組（干預48h），每組3孔。干預結束后，各組加入1mL低糖DMEM培養液再孵育半小時，然后加入3H-D-葡萄糖繼續孵育1h。洗滌細胞后將細胞溶解，取100μL測定蛋白質濃度。冷乙醇（660μL/mL）溶液洗滌2次，離心棄上清，將沉淀物置于濾紙片上，洗滌后烤干，置于10mL閃爍液中，用液體閃爍儀測定放射性計數，得出3H-D-葡萄糖摻入率，單位為nmol·mg-1·h-1。

1.6 檢測心肌細胞脂聯素的表達

1.6.1 RT-PCR檢測脂聯素mRNA的表達：引物序 列 為 脂 聯 素 正 義 鏈 5′ -CAGGAGATGCTGGAATGA-3′，反義鏈 5′-GATACTGGTCGTAGGTGAAG-3′；β-actin正義鏈5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義鏈5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。按照Trizol試劑說明書提取心肌細胞總RNA并進行逆轉錄反應，共35個循環，PCR產物10μL經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色、照相并經光密度儀掃描分析，以βactin光密度值進行標準校正，計算APN產物的相對量。

1.6.2 心肌細胞脂聯素蛋白表達水平的檢測：裂解液裂解細胞后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用水浴式電印跡法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉4h后，加入兔抗APN多克隆抗體稀釋液，4℃過夜，用含體積分數為0.5%Tween-20的磷酸緩沖液洗3遍，再加入熒光染料標記的羊抗兔IgG（1∶5 000，Rockland IRDye800CW）二抗稀釋液，37℃振 1h后用磷酸緩沖液洗 3遍，用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統儀器掃描PVDF膜后用成像分析軟件進行分析，計算每組與β-actin表達量的比值。

1.7 統計學方法：應用SPSS13.0進行統計分析，計量資料以±s表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，兩變量間相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化：干預24h和48h后，G組心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；Ins組、G+Ins組心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率均較對照組顯著下降（P＜0.05）。見表1。

2.2 心肌細胞脂聯素mRNA和蛋白表達的變化：應用高糖、高胰島素、高糖+高胰島素干預48h后，G組心肌細胞脂聯素mRNA表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；Ins組、G+Ins組心肌細胞脂聯素mRNA表達均較對照組顯著下降（P＜0.05）。G組、Ins組、G+Ins組心肌細胞脂聯素蛋白表達均較對照組顯著下降（P＜0.05）。見表2。

表1 干預24、48h后心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化Table 1 IncorPoration rate of3H-D-glucose in different grouPs of myocardial cells after 24，48-hour treatment（n=8，±s，nmol·mg-1·h-1）

表1 干預24、48h后心肌細胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化Table 1 IncorPoration rate of3H-D-glucose in different grouPs of myocardial cells after 24，48-hour treatment（n=8，±s，nmol·mg-1·h-1）

*P＜0.05 vs control group by q test

Groups Incorporation rate of3HD-glucose after 24h Incorporation rate of3HD-glucose after 48h Control 14.07±0.27 14.06±0.43 G 13.33±0.76 13.58±0.49 Ins 12.48±0.90* 12.46±1.11*G+Ins 10.64±0.95* 10.61±1.14*

表2 干預48h后心肌細胞脂聯素mRNA和蛋白表達比較Table 2 AdiPonectin mRNA and Protein level in different grouPs of myocardial cells after 48h treatment（n=8，±s）

表2 干預48h后心肌細胞脂聯素mRNA和蛋白表達比較Table 2 AdiPonectin mRNA and Protein level in different grouPs of myocardial cells after 48h treatment（n=8，±s）

*P＜0.05 vs control group by q test

Groups Adiponectin mRNA Adiponectin protein Control 0.77±0.08 0.89±0.27 G 0.66±0.09 0.64±0.23*Ins 0.35±0.04* 0.37±0.13*G+Ins 0.38±0.04* 0.22±0.08*

2.3 直線相關分析：應用高糖、高胰島素、高糖+高胰島素干預48h后，對照組、G組、Ins組、G+Ins組3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細胞脂聯素mRNA表達量均呈正相關（r=0.92、0.82、0.89、0.86，P均＜0.05）。

3 討 論

胰島素抵抗是指機體對胰島素生理作用的反應性降低或敏感性降低。產生胰島素抵抗的主要部位在肝臟、肌肉和脂肪組織［1］。研究［2］發現，約25%正常人群存在胰島素抵抗，糖耐量減低人群75%存在胰島素抵抗，2型糖尿病患者胰島素抵抗的發生率為85%左右。

研究胰島素抵抗機制以及藥物對胰島素抵抗的影響離不開胰島素抵抗細胞模型，因此建立可靠的模型極為重要。目前已成功復制出數種胰島素抵抗細胞模型，這些細胞模型主要有地塞米松誘導模型、高胰島素誘導培養模型、高類固醇培養模型、腫瘤壞死因子誘導模型、游離脂肪酸誘導模型等，其中以高胰島素培養模型最為穩定、可靠，使用也最為廣泛。但這些模型細胞均為脂肪細胞、骨骼肌細胞、肝臟細胞。目前已知與胰島素抵抗相關的最重要部位是代謝較旺盛的肝臟、骨骼肌、脂肪。心肌也是人體代謝最旺盛的器官之一。有學者［3］發現，胰島素受體同樣在心肌細胞表面表達，其受體數目受胰島素水平的調節。當胰島素受體數目下調至一定程度時，則該細胞對胰島素的作用產生抵抗［4］。有學者［5］在研究犬體外循環心肌缺血-再灌注損傷時發現，在強應激過程中，不僅機體全身發生了胰島素抵抗，而且作為胰島素靶組織之一的心肌也發生了胰島素抵抗。有學者［6-7］在糖尿病高血糖狀態下對心肌細胞進行研究，發現高血糖激活了細胞多元醇代謝通路，最終導致肌醇代謝紊亂、細胞內Na+-K+-ATP酶活性下降、鈣離子泵功能障礙、葡萄糖轉運異常，引起心肌細胞結構與功能受損。但目前針對心肌細胞的胰島素抵抗研究，國內外尚未見報道。因此，胰島素抵抗心肌細胞模型的建立對研究心肌細胞局部胰島素抵抗的發生機制具有重要意義。

胰島素抵抗的代表性特征是高胰島素血癥、高血糖和內環境紊亂等［8-9］。高血糖、高胰島素血癥本身可能誘導胰島素抵抗的發生［10］。因此，本研究采用高濃度葡萄糖、高濃度胰島素誘導心肌細胞，排除機體全身體液、神經調節的因素影響，進一步探討高濃度葡萄糖、高濃度胰島素對體外心肌細胞胰島素敏感性的影響。

3H-D-葡萄糖摻入實驗是目前較為常用的評價細胞胰島素敏感性的方法之一［11］。脂聯素被認為是胰島素抵抗的標記物［12］。有研究［13］表明高脂飼料喂養的胰島素抵抗大鼠模型內臟脂肪組織脂聯素表達減低，羅格列酮干預后可上調脂肪組織脂聯素的表達，降低空腹胰島素水平，改善胰島素抵抗。脂聯素基因敲除的純合子小鼠可表現出中度的胰島素抵抗及輕度的葡萄糖耐量減低，提示脂聯素具有糾正胰島素抵抗的作用［14］。單次給予脂聯素后，高脂高蔗糖飲食小鼠血中脂肪酸和三酰甘油明顯降低、體質量增加［15］。上述研究表明脂聯素與胰島素敏感性密切相關，脂聯素表達水平越低，胰島素抵抗越嚴重。本研究運用高葡萄糖、高胰島素、高葡萄糖+高胰島素3種方法誘導心肌細胞，結果表明3組心肌細胞脂聯素表達均下降。但高葡萄糖誘導法3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細胞脂聯素mRNA表達較對照組差異無統計學意義，未能誘導出胰島素抵抗。而高胰島素誘導法、高葡萄糖+高胰島素法均可促使3H-D-葡萄糖摻入率顯著下降、脂聯素表達下降，促使細胞發生胰島素抵抗。同時，3組中3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細胞脂聯素表達均呈顯著正相關，進一步證明了心肌細胞脂聯素是心肌細胞胰島素抵抗的標志物。

胰島素抵抗不一定都伴有高血糖，高葡萄糖+高胰島素誘導的胰島素抵抗心肌細胞更符合高血糖伴胰島素抵抗的2型糖尿病機體的內環境狀態，更適合作為研究2型糖尿病的心肌細胞模型。

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（本文編輯：趙麗潔）

ESTABLISHMENT AND EVALUATION OF INSULIN RESISTANCE CARDIOCYTES MODEL

WANG Mei，LI Yongjun*，LIU Suyun，ZHANG Hui，YANG Rong，MIAO Chenglong
（Department of Cardiology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo establish insulin resistance cardiocytes model.MethodsCardiocytes were cultured for 24h and 48h in vitro and were divided into four groups：control group（control），glucose group（G），insulin group（Ins），glucose and insulin group（G+Ins）.The adiponectin（APN）expression in those groups was tested and the insulin sensitivity was evaluated by3H-D -glucose mixing experiment.Results3H-D-glucose mixing rate in Ins group（12.46±1.11）nmol·mg-1·h-1and G+Ins group（10.61±1.14）nmol·mg-1·h-1were all lower than control group（14.06±0.43）nmol· mg-1·h-1（P＜0.05）.APN expression in Ins group 0.35±0.04，G+Ins group 0.38±0.04，were all lower than control group 0.77±0.08 after 48h（P＜0.05）.3H-D-glucose mixing rate in four groups was positively related to APN expression（P＜0.05）.ConclusionThe insulin resistance cardiocytes model can be established by high insulin or high glucose+insulin.Insulin resistance down-regulates cardiocytes adiponectin expression.Insulin resistance is positively related to APN expression.

myocytes，cardiac；insulin；models，animal

R965.1

A

1007-3205（2012）09-0993-04

2012-03-10；

2012-06-14

河北省衛生廳重大科技攻關項目（20100075）

王梅（1973-），女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學博士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：lyjbs2009@yeah.net

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.001