干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的變化

閻雙緩，曹志宸

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科，河北，石家莊050051）

干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的變化

閻雙緩1，曹志宸2

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科，河北，石家莊050051）

目的探討慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者干擾素治療前后外周血單核細(xì)胞To11樣受體4（To11-1ike receptor4，TLR4）的變化及其意義。方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)30例健康人、65例CHB患者外周血單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)上述患者血清白細(xì)胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）的水平。結(jié)果CHB患者組與健康對(duì)照組比較，外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平及血清IL-6水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。患者應(yīng)用干擾素治療12周時(shí)TLR4水平及IL-6水平均下降，但與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療24周時(shí)，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TLR4可能與CHB發(fā)病有關(guān)，干擾素抗病毒治療可降低外周血單核細(xì)胞TLR4水平。

肝炎，乙型，慢性；單核細(xì)胞；白細(xì)胞介素6

To11樣受體（To11-1ike receptors，TLRs）是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁［1-2］，To11樣受體4（To11-1ike receptor 4，TLR4）主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上，它識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMPs）而引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。本研究以慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，

CHB）患者為對(duì)象，觀察其干擾素治療前后外周血單核細(xì)胞表面TLR4受體表達(dá)水平，探討TLR4在CHB中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2010年2月—2011年2月石家莊市第五醫(yī)院住院CHB患者65例，男性42例，女性23例，年齡35～76歲，平均（51.5±15.2）歲。診斷符合2000年西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。e抗原陽(yáng)性患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞104U/mL，e抗原陰性患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞103U/mL，排除其他甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或人免疫缺陷病毒的合并感染及肝硬化、肝癌等失代償肝病患者，近3個(gè)月未用過(guò)抗病毒藥物及糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。健康對(duì)照組30例，男性18例，女性12例，年齡22～66歲，平均（31.5±11.3）歲。

1.2 治療方案：所有CHB患者給予干擾素α-2b 針500萬(wàn)U隔日1次（北京凱因益生，批號(hào)S20030032），治療12、24周時(shí)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLR4水平及血清IL-6水平。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLR4：清晨抽取靜脈血2mL，用0.2%乙二胺四乙酸抗凝，4h內(nèi)檢測(cè)。取乙二胺四乙酸抗凝血細(xì)胞懸液100μL，分別加入APC-anti-CD14單抗10μL和PE-anti-TLR4單抗10μL，室溫放置30min，加入紅細(xì)胞裂解液2mL，避光靜置15min，離心，1 000μL磷酸鹽緩沖液振蕩洗滌2次，不加抗體設(shè)置陰性對(duì)照。離心棄去保存液，所得細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度至2×109/L，將標(biāo)本置于流式細(xì)胞儀上，以APC-anti-CD14陽(yáng)性設(shè)門，共獲取門內(nèi)10 000個(gè)單核細(xì)胞。經(jīng)Ce11quest統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強(qiáng)度（mean f1uo-rescence intensity，MFI）表示TLR4的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.2 血清白細(xì)胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）水平檢測(cè)：清晨采集靜脈血5mL，常規(guī)離心后取上清液，-80℃冰箱保存，待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒為晶美生物有限公司分裝的美國(guó)Genzyme公司產(chǎn)品。

1.3.3 血HBV-DNA檢測(cè)：采用PCR結(jié)合熒光探針的體外DNA擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)定量檢測(cè)DNA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)及線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血單核細(xì)胞TLR4水平及血清IL-6水平的表達(dá)：CHB患者組治療前與正常對(duì)照組比較，外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平及血清IL-6水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與治療前比較，患者應(yīng)用干擾素針治療12周時(shí)TLR4水平及IL-6水平均下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療24周時(shí)，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。CHB患者經(jīng)干擾素針治療后HBV-DNA呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），見(jiàn)表1，2。

2.2 外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)與血清IL-6水平的關(guān)系：CHB患者組外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（r=0.768，P＜0.05）。

表1 CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

表1 CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

*P＜0.05 #P＜0.01與對(duì)照組比較；△P＜0.05 ☆P＜0.01與治療前比較（q檢驗(yàn)）

組別例數(shù)TLR4 （MFI）IL-6 （ρ/ng·L-1）健康對(duì)照組303.2±2.115.6±5.6 CHB患者組治療前657.5±3.6*94.5±52.2#CHB患者組治療12周656.4±8.479.5±36.6 CHB患者組治療24周654.5±3.6△38.4±12.8☆

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對(duì)數(shù)值變化（n=65，±s）

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對(duì)數(shù)值變化（n=65，±s）

*P＜0.05與治療前比較（q檢驗(yàn)）

檢測(cè)時(shí)間HBV-DNA（1og U/mL）CHB患者組治療前6.98±1.52 CHB患者組治療12周5.56±1.25 CHB患者組治療24周3.17±2.51*

3 討 論

免疫介導(dǎo)的肝損傷是多種慢性肝病的主要發(fā)病機(jī)制，TLRs信號(hào)系統(tǒng)在肝細(xì)胞損傷中起重要作用。其中TLR4的識(shí)別譜較廣，生物學(xué)作用廣泛，它表達(dá)于細(xì)胞表面，能直接識(shí)別病毒蛋白顆粒，不但具有促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟、分化和功能化等作用，還在調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)入侵病原體的免疫應(yīng)答水平及抗病毒方面有不容忽視的作用［4］。Mozer-Lisewska等［5］在HBV感染兒童患者的肝組織中發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)，而正常肝組織則無(wú)表達(dá)。提示TLR4在乙型肝炎發(fā)病中的作用是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。

本研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4水平高于健康人，且外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6表達(dá)水平呈正相關(guān)。與尉秀清等［6］的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于TLR4表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究還比較少。內(nèi)毒素是TLR4最重要的配體，體內(nèi)內(nèi)毒素等刺激信號(hào)以及IL-6高水平的表達(dá)可導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞TLR4高水平的表達(dá)［6-7］。在CHB患者體內(nèi)存在內(nèi)毒素、凋亡細(xì)胞等TLR4刺激信號(hào)［8-9］，有可能導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞對(duì)上述刺激信號(hào)產(chǎn)生過(guò)度反應(yīng)，以及單核細(xì)胞IL-6高水平表達(dá)。IL-6可以通過(guò)多種信號(hào)通路導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死，慢性乙型肝炎血清IL-6的水平與病情進(jìn)展有關(guān)，與肝臟炎癥程度相關(guān)［10-11］。總之，CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6表達(dá)水平可以互相影響，從而在慢性乙型肝炎發(fā)病中發(fā)揮一定作用。

本研究中所有患者均肌內(nèi)注射干擾素抑制HBV。結(jié)果表明，干擾素治療后隨著患者HBVDNA載量下降，外周血單核細(xì)胞TLR4水平及血清IL-6水平均為下降趨勢(shì)，治療24周時(shí)已降至正常水平。干擾素兼具抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效，隨著抗病毒療程延長(zhǎng)，HBV-DNA載量下降，肝臟炎癥減輕，可能使內(nèi)毒素血癥隨之減輕。內(nèi)毒素等刺激信號(hào)減弱，IL-6水平下降，TLR4水平逐漸降低。

綜上所述，外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與CHB的發(fā)病及治療轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本研究觀察時(shí)間尚短，僅為24周，大部分患者仍在堅(jiān)持治療，我們將繼續(xù)觀察。

［1］ MEDZHITOV R，PRESTON-HURLBURT，JANEWAY CA.A human homo1oguw of the Drosophi1a To11 protein signa1s activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388（6640）：394-397

［2］ 李麗燕.To11樣受體的研究進(jìn)展［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18 （3）：467-469.

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華內(nèi)科雜志，2006，45（2）：162-170.

［4］ 劉勇.To11樣受體4介導(dǎo)非感染性免疫反應(yīng)在器官功能損傷中的作用［J］.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2012，32（1）：76-79.

［5］ MOZER-LISEWSKA J，SLUZEWSKI W，KACKZMAREK M，et a1.Tissue 1oca1ization of To11-1ike receptor in biopsy specimens of 1iver from chi1dren infected with hepatitis C virus［J］.Scand J Immuno1，2005，62（4）：407-412.

［6］ 尉秀清，郭云蔚，文卓夫，等.慢性重型乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞To11樣受體4的變化及其與IL-6的關(guān)系［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23（8）：1563-1565.

［7］ TAMANDL D，BAHRAMI M，WESSNER B，et a1.Modu1ation of to11-1ike receptor 4 expression on human monocytes by tumor necrosis factor and inter1eukin-6 tumor necrosis factor evokes 1ipopo1ysaccharide hyporesponsiveness whereas inter1eukin-6 enhances 1ipopo1ysaccharide activity［J］.Shock，2003，20（3）：224-229.

［8］ 劉偉，劉尚忠，蔣水英，等.慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)毒素和PDGF水平的變化及意義［J］.臨床肝膽病雜志，2009，25（1）：37-38.

［9］ SOZINOV AS.Systemic endotoxemia during chronic vira1 hepatitis ［J］.Bu11 Exp Bio1 Med，2002，133（2）：153-155.

［10］ 張偉英，楊利華，卓凌，等.慢性乙型肝炎患者血清TNF-α、IL-6、IL-10水平及其臨床意義［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（6）：120-121.

［11］ 王友基，高建平.乙肝病毒感染者HBV-DNA與IL-1、IL-6的關(guān)系及臨床意義［J］.福建醫(yī)藥雜志，2010，32（6）：90-91.

（本文編輯：劉斯靜）

R735.7

B

1007-3205（2012）10-1173-03

2012-02-13；

2012-04-06

石家莊市科技局科技支撐項(xiàng)目（09146763）

閻雙緩（1969-），女，河北石家莊人，河北省石家莊市第五醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事病毒性肝炎基礎(chǔ)及臨床研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.023