干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4的變化

閻雙緩，曹志宸

（1.河北省石家莊市第五醫院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫科大學第三醫院中西醫結合肝病科，河北，石家莊050051）

干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4的變化

閻雙緩1，曹志宸2

（1.河北省石家莊市第五醫院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫科大學第三醫院中西醫結合肝病科，河北，石家莊050051）

目的探討慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者干擾素治療前后外周血單核細胞To11樣受體4（To11-1ike receptor4，TLR4）的變化及其意義。方法用流式細胞儀檢測30例健康人、65例CHB患者外周血單核細胞表面TLR4的表達，酶聯免疫吸附測定法檢測上述患者血清白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）的水平。結果CHB患者組與健康對照組比較，外周血單核細胞TLR4表達水平及血清IL-6水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。患者應用干擾素治療12周時TLR4水平及IL-6水平均下降，但與治療前比較差異無統計學意義（P＞0.05）；治療24周時，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論TLR4可能與CHB發病有關，干擾素抗病毒治療可降低外周血單核細胞TLR4水平。

肝炎，乙型，慢性；單核細胞；白細胞介素6

To11樣受體（To11-1ike receptors，TLRs）是連接天然免疫及獲得性免疫系統的重要橋梁［1-2］，To11樣受體4（To11-1ike receptor 4，TLR4）主要表達在巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及內皮細胞上，它識別病原體相關分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMPs）而引起機體特異性免疫反應。本研究以慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，

CHB）患者為對象，觀察其干擾素治療前后外周血單核細胞表面TLR4受體表達水平，探討TLR4在CHB中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2010年2月—2011年2月石家莊市第五醫院住院CHB患者65例，男性42例，女性23例，年齡35～76歲，平均（51.5±15.2）歲。診斷符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準［3］。e抗原陽性患者丙氨酸轉氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞104U/mL，e抗原陰性患者丙氨酸轉氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞103U/mL，排除其他甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或人免疫缺陷病毒的合并感染及肝硬化、肝癌等失代償肝病患者，近3個月未用過抗病毒藥物及糖皮質激素等影響免疫功能的藥物。健康對照組30例，男性18例，女性12例，年齡22～66歲，平均（31.5±11.3）歲。

1.2 治療方案：所有CHB患者給予干擾素α-2b 針500萬U隔日1次（北京凱因益生，批號S20030032），治療12、24周時檢測外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平。

1.3 檢測方法

1.3.1 流式細胞儀檢測外周血單核細胞TLR4：清晨抽取靜脈血2mL，用0.2%乙二胺四乙酸抗凝，4h內檢測。取乙二胺四乙酸抗凝血細胞懸液100μL，分別加入APC-anti-CD14單抗10μL和PE-anti-TLR4單抗10μL，室溫放置30min，加入紅細胞裂解液2mL，避光靜置15min，離心，1 000μL磷酸鹽緩沖液振蕩洗滌2次，不加抗體設置陰性對照。離心棄去保存液，所得細胞以磷酸鹽緩沖液調整濃度至2×109/L，將標本置于流式細胞儀上，以APC-anti-CD14陽性設門，共獲取門內10 000個單核細胞。經Ce11quest統計軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強度（mean f1uo-rescence intensity，MFI）表示TLR4的表達強度。

1.3.2 血清白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）水平檢測：清晨采集靜脈血5mL，常規離心后取上清液，-80℃冰箱保存，待測。酶聯免疫吸附測定試劑盒為晶美生物有限公司分裝的美國Genzyme公司產品。

1.3.3 血HBV-DNA檢測：采用PCR結合熒光探針的體外DNA擴增和檢測技術定量檢測DNA含量。

1.4 統計學方法：應用SAS6.12統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用q檢驗及線性相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平的表達：CHB患者組治療前與正常對照組比較，外周血單核細胞TLR4表達水平及血清IL-6水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與治療前比較，患者應用干擾素針治療12周時TLR4水平及IL-6水平均下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）；治療24周時，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。CHB患者經干擾素針治療后HBV-DNA呈下降趨勢（P＜0.05），見表1，2。

2.2 外周血單核細胞TLR4的表達與血清IL-6水平的關系：CHB患者組外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平呈現顯著的正相關（r=0.768，P＜0.05）。

表1 CHB患者外周血單核細胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

表1 CHB患者外周血單核細胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

*P＜0.05 #P＜0.01與對照組比較；△P＜0.05 ☆P＜0.01與治療前比較（q檢驗）

組別例數TLR4 （MFI）IL-6 （ρ/ng·L-1）健康對照組303.2±2.115.6±5.6 CHB患者組治療前657.5±3.6*94.5±52.2#CHB患者組治療12周656.4±8.479.5±36.6 CHB患者組治療24周654.5±3.6△38.4±12.8☆

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對數值變化（n=65，±s）

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對數值變化（n=65，±s）

*P＜0.05與治療前比較（q檢驗）

檢測時間HBV-DNA（1og U/mL）CHB患者組治療前6.98±1.52 CHB患者組治療12周5.56±1.25 CHB患者組治療24周3.17±2.51*

3 討 論

免疫介導的肝損傷是多種慢性肝病的主要發病機制，TLRs信號系統在肝細胞損傷中起重要作用。其中TLR4的識別譜較廣，生物學作用廣泛，它表達于細胞表面，能直接識別病毒蛋白顆粒，不但具有促進細胞因子的合成與釋放，促進免疫細胞成熟、分化和功能化等作用，還在調節機體對入侵病原體的免疫應答水平及抗病毒方面有不容忽視的作用［4］。Mozer-Lisewska等［5］在HBV感染兒童患者的肝組織中發現TLR4的表達，而正常肝組織則無表達。提示TLR4在乙型肝炎發病中的作用是一個值得探討的問題。

本研究結果顯示，CHB患者外周血單核細胞TLR4水平高于健康人，且外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平呈正相關。與尉秀清等［6］的研究結果一致。目前關于TLR4表達的調控機制研究還比較少。內毒素是TLR4最重要的配體，體內內毒素等刺激信號以及IL-6高水平的表達可導致外周血單核細胞TLR4高水平的表達［6-7］。在CHB患者體內存在內毒素、凋亡細胞等TLR4刺激信號［8-9］，有可能導致外周血單核細胞對上述刺激信號產生過度反應，以及單核細胞IL-6高水平表達。IL-6可以通過多種信號通路導致肝細胞的凋亡和壞死，慢性乙型肝炎血清IL-6的水平與病情進展有關，與肝臟炎癥程度相關［10-11］。總之，CHB患者外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平可以互相影響，從而在慢性乙型肝炎發病中發揮一定作用。

本研究中所有患者均肌內注射干擾素抑制HBV。結果表明，干擾素治療后隨著患者HBVDNA載量下降，外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平均為下降趨勢，治療24周時已降至正常水平。干擾素兼具抗病毒和免疫調節的雙重功效，隨著抗病毒療程延長，HBV-DNA載量下降，肝臟炎癥減輕，可能使內毒素血癥隨之減輕。內毒素等刺激信號減弱，IL-6水平下降，TLR4水平逐漸降低。

綜上所述，外周血單核細胞TLR4表達水平與CHB的發病及治療轉歸有關。本研究觀察時間尚短，僅為24周，大部分患者仍在堅持治療，我們將繼續觀察。

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（本文編輯：劉斯靜）

R735.7

B

1007-3205（2012）10-1173-03

2012-02-13；

2012-04-06

石家莊市科技局科技支撐項目（09146763）

閻雙緩（1969-），女，河北石家莊人，河北省石家莊市第五醫院副主任醫師，醫學碩士，從事病毒性肝炎基礎及臨床研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.023