氨溴索對百草枯中毒大鼠肺組織損傷NF-κB和細胞凋亡的影響

馬玉騰，劉建輝，蘇建玲，郭憲立，高恒波，姚冬奇

（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院急診科，河北石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院輸血科，河北石家莊 050031）

氨溴索對百草枯中毒大鼠肺組織損傷NF-κB和細胞凋亡的影響

馬玉騰1，劉建輝2，蘇建玲1，郭憲立1，高恒波1，姚冬奇1

（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院急診科，河北石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院輸血科，河北石家莊 050031）

目的探討氨溴索（ambroxo1，AT）對百草枯（paraquat，PQ）中毒大鼠急性肺損傷中性粒細胞（po1ymorphonuc1ear neutrophi1，PMN）凋亡的影響。方法隨機將108只大鼠分為4組，正常對照組（C組）、AT對照組（AT組）、急性肺損傷組（PQ組）和急性肺損傷+AT干預(yù)組（PQ+AT組）。取肺組織HE染色來評價肺組織損傷情況；ELISA檢測血清中白細胞介素-8（inter1eukin-8，IL-8）水平；免疫細胞化學方法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoa1veo1ar 1avage f1uid，BALF）中PMN的核因子-κB（nuc1ear factor kappa B，NF-κB）p65表達；Western B1ot分析定量檢測PMN中胞漿蛋白IκBα的含量；流式細胞儀檢測PMN凋亡率。結(jié)果C組和AT組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)基本完整；PQ組炎性細胞浸潤明顯增多；肺組織損傷程度加重。PQ+AT組肺組織損傷程度較輕。PQ組血清IL-8水平較C組顯著增加（P＜0.01），PQ+AT組較PQ組降低，較C、AT組高（P＜0.01）。PQ中毒能夠引起B(yǎng)ALF中PMN的NF-κB亞基p65核易位和PMN胞漿蛋白IκBα的降解，AT對此具有抑制作用。PQ組3d時PMN的凋亡率最低，PQ+AT組相應(yīng)時間點與PQ組相應(yīng)時間點相比凋亡率均增加（P＜0.05）。結(jié)論PQ中毒導致了大鼠急性肺損傷，經(jīng)AT治療后，使延緩的PMN凋亡恢復(fù)正常，從而有效地減輕了PQ中毒所致的大鼠急性肺損傷。

百草枯；肺；大鼠

百草枯（paraquat，PQ）屬滅生型高毒性除草劑，若誤服中毒吸收快，對人及動物有極高的肺毒性。PQ中毒早期可造成急性肺損傷（acute 1ung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），目前尚無有效的治療方法［1］，患者多死于多臟器功能衰竭或呼吸衰竭，其發(fā)病機制尚不十分清楚。本研究通過觀察PQ中毒大鼠所致的肺損傷，初步探討PQ中毒所致大鼠ALI時大劑量氨溴索（ambroxo1，AT）是否通過對中性粒細胞（po1ymorphonuc1ear neutrophi1，PMN）凋亡的影響而干預(yù)大鼠肺組織損傷。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理：健康雄性SD大鼠108只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。隨機將大鼠分為4組。①正常對照組（C組，18只），腹腔注射生理鹽水3mL/kg；②AT對照組（AT組，18只），腹腔注射AT 35mg/kg；③ALI組（PQ組，36只），大鼠腹腔注入 2% PQ液（25mg/kg，英國捷利康有限公司提供）制作PQ中毒ALI模型；④ALI+AT干預(yù)組（PQ+AT組，36只），染毒后腹腔注射AT（35mg/kg），每天同一時間注射。后2組又分別以腹腔注射PQ后的1、3、5d作觀測點，處死動物、取材，每個時間點12只大鼠。

1.2 血漿白細胞介素-8（inter1eukin-8，IL-8）水平的測定和肺組織HE染色：實驗開始后第1、3、5天處理大鼠，首先取靜脈血離心，將血清置-70℃冰箱保存，待測IL-8。ELISA方法操作嚴格按照說明書進行。肺組織取材后，常規(guī)HE染色。

1.3 大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoa1veo1ar 1avage f1uid，BALF）中 PMN的分離：收集支氣管BALF后離心留取上清備用，沉淀重新懸浮后，進行密度梯度離心，PMN富集層進行瑞氏-姬姆薩染色，PMN純度＞88%方可進行下一步實驗。

1.4 免疫細胞化學檢測 PMN的核因子 -κB（nuc1ear factor kappa B，NF-κB）亞基p65核易位：一抗采用兔抗NF-κB p65多抗，相應(yīng)生物素標記的第二抗體及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒。陰性對照用PBS代替一抗。體積較小且核分葉的細胞為PMN。操作過程按試劑盒說明書進行。

1.5 采用Western B1ot分析定量檢測PMN胞漿蛋白中IκBα的含量：一抗采用兔抗IκBα多抗。

1.6 流式細胞儀檢測PMN凋亡率：BALF中提純的PMN懸液經(jīng)碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料避光染色10min后，上流式細胞儀，染色陽性為凋亡細胞。

1.7 統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，分別采用t檢驗、方差分析及q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織損傷情況：C組、AT組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞滲出。PQ組肺間隔增厚，肺泡壁斷裂，大量PMN等炎癥細胞浸潤，且隨時間的延長炎性細胞浸潤增多，肺組織損傷程度加重。PQ+ AT組肺組織有同PQ組相似的病理表現(xiàn)，但對應(yīng)時間點肺組織損傷程度較輕（圖1）。

圖1 3組大鼠肺組織損傷情況（HE×200）A.C組；B.PQ組；C.PQ+AT組Figure 1 The injury of 1ung tissue in rats of three groups（HE ×200）A.Group C；B.Group PQ；C.Group PQ+AT

2.2 血清IL-8水平：血清IL-8水平PQ組較C組和AT組顯著增加（P＜0.01），而PQ+AT組較PQ組降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-8水平Table 1 The expression of IL-8 in the serum of each group of rats（±s，ρ/ng·L-1）

表1 各組大鼠血清IL-8水平Table 1 The expression of IL-8 in the serum of each group of rats（±s，ρ/ng·L-1）

*P＜0.01 vs the other three groups by q testAT：ambroxo1；PQ：paraquat

Groups n IL-8 1d 3d 5d C 18 39.42±8.35 25.20±3.58 29.85±5.12 AT 18 24.59±2.87 28.54±2.91 21.56±3.62 PQ 36 725.98±66.43* 885.87±85.18*794.60±76.36*PQ+AT 36 395.23±40.24* 385.84±45.57*312.88±33.62*

2.3 免疫細胞化學結(jié)果：PQ中毒能夠引起B(yǎng)ALF中PMN的NF-κB亞基p65核易位，即棕黃色陽性信號位于胞核，AT對此具有抑制作用，陽性信號位于胞漿中。見圖2。

圖2 2組大鼠免疫組織化學結(jié)果（ ×400）A.PQ組；B.PQ+AT組Figure 2 The resu1ts of immunocytochemistry in rats of two groups（ × 400）A.Group PQ；B.Group PQ+AT

2.4 Western B1ot結(jié)果：PQ中毒后引起PMN胞漿蛋白中IκBα的降解，AT對此具有抑制作用。見圖3。

圖3 3組大鼠IκBα Western B1ot結(jié)果*P＜0.01與C組比較 #P＜0.01與PQ組比較（t檢驗）Figure 3 The IκBα resu1ts of Western B1ot in rats of three groups*P＜0.01 vs group C #P＜0.01 vs group PQ by t test

2.5 BALF中PMN的凋亡率：C組與AT組比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PQ組各時間點PMN的凋亡率（1、3、5d）均較C組降低（P＜0.05），其中3d時PMN的凋亡率最低，此時細胞壽命最長（P＜0.05）；PQ+AT組各時間點（1、3、5d）與PQ組相應(yīng)時間點相比凋亡率均增加（P＜0.05），但與C組和AT組相比，PMN的凋亡率仍較低（P＜0.05）。見表2。

表2 BALF中各組PMN的凋亡率Table 2 The rate of PMN apoptosis in BALF of each group of rats（%）

3 討 論

本實驗觀察到，腹腔注射2%PQ液1d后，大鼠呼吸加快、窘迫，口唇及趾端明顯發(fā)紺，其病理組織學改變已達到ALI的標準，可以作為PQ中毒ALI的動物模型用于實驗研究。大鼠PQ中毒后1d，即出現(xiàn)較嚴重的肺組織損傷，3d時肺組織損傷最嚴重［2］。

ALI的特點是肺泡毛細血管屏障的損傷，PMN的積累以及促炎性細胞因子的誘導。其中PMN在ALI時發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［3-4］，它們是宿主抗感染機制的第一反應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)腹腔注射PQ的確引起了BALF中PMN大量浸潤。在炎癥過程中凋亡調(diào)控著PMN數(shù)量和反應(yīng)性，保持炎癥反應(yīng)的適度水平。這種凋亡和清除間的動態(tài)平衡既防止了PMN的過度過量激活加重炎癥反應(yīng)，又能夠避免凋亡的PMN繼發(fā)性壞死釋放毒性內(nèi)容物，加重周圍組織損傷［5］。ALI時PMN的凋亡發(fā)生延遲，PMN的壽命和損傷組織的時間將會延長。已有臨床資料表明PMN壽命的延長，繼而持續(xù)分泌炎癥介質(zhì)與ARDS的發(fā)生率和病死率均呈正相關(guān)關(guān)系［6］。本實驗采用流式細胞儀檢測BALF中PMN的凋亡，證實PQ中毒所致大鼠ALI后PMN凋亡延遲，提示PMN凋亡延遲可能是ALI引起PMN在肺內(nèi)大量聚集、浸潤、持續(xù)發(fā)揮作用。

IL-8是一種強而有力的PMN趨化和活化因子，其生物學作用是趨化并激活PMN，使PMN外型改變，促使其脫顆粒；激活PMN并使其產(chǎn)生呼吸爆炸，促進PMN的溶酶體酶活性和吞噬作用，同時對嗜堿性粒細胞和T細胞也有一定的趨化作用，IL-8水平升高與PMN、淋巴細胞升高相一致，IL-8有可能作為炎癥反應(yīng)與肺損傷嚴重性的早期標志。

NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在非活化狀態(tài)下，NF-κB存在于靜止期細胞胞漿，是p50、p65與抑制蛋白IκB結(jié)合的多聚體［7］。NF-κB的激活在多種細胞起著抑制凋亡，延長生存時間。PQ中毒后大量NF-κB被刺激活化［8-9］，與IκB分離而進入細胞核，進而參與下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，誘導炎癥反應(yīng)。我們采用免疫細胞化學方法檢測BALF細胞涂片PMN中的NF-κB p65亞基的核易位，發(fā)現(xiàn)腹腔注射PQ引起PMN中的NF-κB p65亞基核易位，而AT對此具有明顯的抑制作用。

AT是一種具有多種生物學效應(yīng)的黏液溶解劑。近年來有研究顯示，大劑量AT可減少超氧陰離子及H2O2等的生成，減輕肺氧化性損傷［10］；減少多種炎癥細胞及炎癥介質(zhì)的釋放，減輕過度炎癥反應(yīng)所引起的肺破壞作用。大劑量AT具有一定的抗炎、抗氧化的作用，對于PQ中毒有明顯的治療作用［11］。我們的實驗結(jié)果首次在整體水平發(fā)現(xiàn)AT通過抑制NF-κB促進PMN凋亡，這也是AT對抗PQ所致ALI的重要機制之一。

本實驗通過探討NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的多個環(huán)節(jié)在調(diào)控PMN凋亡中的作用，可為臨床防治炎癥性疾病提供新的思路。因而采取有效措施進行干預(yù)，適時適度清除不需要的、處于持續(xù)激活狀態(tài)的PMN，對于控制炎癥反應(yīng)的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要，從而為臨床治療ALI提供理論依據(jù)，為開拓新的治療思路提供參考。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECTS OF AMBROXOL ON NF-κB AND CELL APOPTOSIS IN LUNG INJURY ASSOCIATED WITH PARAQUAT POISONING OF RATS

MA Yuteng1，LIU Jianhui2，SU Jian1ing1，GUO Xian1i1，GAO Hengbo1，YAO Dongqi1
（1.Department of Emergenct Medicine，the Second Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050000，China；
2.Department of Blood Transfusion，the Hebei Province Peopleˊs Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo investigate the effects of ambroxo1（AT）on nuc1ear factor kappa B（NF-κB）and po1ymorphonuc1ear neutrophi1（PMN）apoptosis in 1ung injury associated with paraquat（PQ）poisoning of rats.MethodsA tota1 of 108 rats were random1y divided into four groups：contro1 group，group AT，group PQ and group PQ+AT.Lung tissue was stained with hemotoxy1in and eosin（HE）to eva1uate the patho1ogica1 change.The 1eve1 of inter1eukin-8（IL-8）in serum was detected by ELISA.The expression of NF-κB p65 in PMN of bronchoa1veo1ar 1avage f1uid（BALF）was determined by using immunohistochemisca1 method.The content of IκBα of cytop1asm protein was determined by Western B1ot ana1ysis.The ratio of PMN apoptosis was assayed by f1ow cytometry.ResultsThe structure of 1ung tissue was integrated in group C and group AT.Inf1ammatory ce11 infi1tration increased obvious1y and the degree of 1ung injury was severe in group PQ；The degree of 1ung injury was 1ighter in group PQ+ AT.The content of IL-8 in group PQ was significant1y higher than that of group C（P＜0.01）.The content of IL-8 in group PQ+AT was 1ower than that of group PQ，and higher than that of group C andAT（P＜0.01）.Paraquat poisoning caused NF-κB subunit p65 trans1ocation and IκBα degradation in PMN of BALF.Ambroxo1 had inhibitory effect on these changes.The ratio of PMN apoptosis in group PQ was the 1owest on the third day.The ratio of PMN apoptosis in group PQ+AT was higher than that of group PQ on corresponding time（P＜0.05）。ConclusionParaquat poisoning can 1ead to acute 1ung injury in rats.After using ambroxo1（AT），the process of PMN apoptosis regain norma1 and 1ighten the 1ung injury associated with paraquat poisoning of rats.

paraquat；1ung；rats

R563.9

A

1007-3205（2012）04-0421-04

2011-12-06；

2012-03-09

河北省科學技術(shù)攻關(guān)計劃項目（0520611034D-6）

馬玉騰（1966-），男，河北景縣人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事急診醫(yī)學診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.018