銅綠假單胞菌抗菌物質對白色念珠菌的體外抑菌活性研究

楊寶友，李仲興，秦金喜

（1.河北省玉田縣醫院檢驗科，河北玉田 064100；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000；3.河北省徐水縣人民醫院檢驗科，河北徐水 072550）

銅綠假單胞菌抗菌物質對白色念珠菌的體外抑菌活性研究

楊寶友1，李仲興2*，秦金喜3

（1.河北省玉田縣醫院檢驗科，河北玉田 064100；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000；3.河北省徐水縣人民醫院檢驗科，河北徐水 072550）

目的觀察銅綠假單胞菌抗菌物質對白色念珠菌的體外抑菌活性。方法用交叉條帶實驗方法測定銅綠假單胞菌對18株白色念珠菌等的體外抑制活性。結果銅綠假單胞菌抗菌物質對白色念珠菌體外抑菌活性良好，第6和8株銅綠假單胞菌對白色念珠菌的抑制率均達到了100%，銅綠假單胞菌產生色素的菌株抗真菌活性顯著優于不產色素的菌株。銅綠假單胞菌抑制白色念珠菌的生長，主要是銅綠假單胞菌產生的綠膿素。結論銅綠假單胞菌產生的抗菌物質對白色念珠菌具有較強的抗真菌活性。

假單胞菌，銅綠；念珠菌，白色；抑菌活性

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是臨床上引起人類多種感染的重要致病菌，同時，它產生的抗菌物質，還具有抑制其他細菌的能力［1］，白色念珠菌是最常見的致病性真菌，深部真菌感染以白色念珠菌（又稱白色假絲酵母）居多，占76.40%［2］，所引起的肺部感染其治療也很困難。銅綠假單胞菌對臨床分離的白色念珠菌是否有抑制作用，國內尚無報告。為此，我們隨機選取10株銅綠假單胞菌，分別對18株白色念珠菌進行了體外抑菌實驗，結果較為滿意，報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定：10株銅綠假單胞菌為我院臨床標本，主要來自于痰標本，18株白色念珠菌等從陰道分泌物、痰和血液等標本分離而來。兩種細菌均按臨床微生物學手冊等進行鑒定［3-4］。

1.2 培養基：Mue11er-Hinton瓊脂（M-H瓊脂），英國 OXOID 公司生產，批號 992952。沙堡（sabouraud）培養基，北京陸橋有限公司生產，批號110324。

1.3 菌液制備：將銅綠假單胞菌接種于M-H瓊脂上，將各指示念珠菌接種于沙堡瓊脂培養基上，35℃均培養18～24h，分別取其菌落用M-H肉湯和沙堡肉湯制成約為108cfu/mL的菌懸液。

1.4 實驗方法：將銅綠假單胞菌懸液劃線接種于沙氏瓊脂平板中央，使其呈一條寬為6mm的接種線，35℃培養24h后，在接種線上生長的菌落呈現一條菌落條帶，用無菌玻片輕輕刮去條帶上生長的菌苔，將平皿倒置，平皿蓋內放一直徑為5cm的浸氯仿濾紙片（用于殺死殘存的銅綠假單胞菌），35℃置15min，打開平皿取出氯仿濾紙片，待平皿內氯仿揮發完畢后，分別將白色念珠菌的菌懸液，于原銅綠假單胞菌生長條帶呈垂直交叉劃線接種，35℃培養24h后觀察結果。

1.5 結果判讀：在原銅綠假單胞菌生長帶上，被測菌仍沿劃線生長，無抑菌帶出現為耐藥（陰性），出現6 mm及以上的抑菌帶為敏感（陽性）。

2 結 果

10株銅綠假單胞菌對18株白色念珠菌共進行了180次體外抑菌實驗，結果是敏感95次，耐藥85次，抑菌率52.28%，平均抑菌帶寬度28.44mm。

2.1 銅綠假單胞菌對白色念珠菌的抑菌情況：5、6和8號銅綠假單胞菌的抑菌活性最強，抑菌率達94%～100%。但1、7和10號菌株幾乎無抑菌效果。說明銅綠假單胞菌的不同菌株對白色念珠菌的抑菌效果也不同。被銅綠假單胞菌抗菌物質所抑制的抑菌帶很寬，幾乎占了整個平板（直徑90mm）的一半；說明銅綠假單胞菌對白色念珠菌的抑菌活性很強，見表1，圖1。

表1 銅綠假單胞菌對18株白色念珠菌敏感菌株的體外抑菌活性Table 1 In vitro inhibitory activity of antimicrobial substance of P.aeruginosa against Candida.albicans

圖1 銅綠假單胞菌產生的抗菌物質對白色念珠菌的抑菌作用，兩邊各4條帶為白色念珠菌的菌落，當中空白處為抑制區（白色念珠菌不能生長）

Figure 1 Bacteriostatic action of Pseudomonas.aeruginosa by producing antimicrobia1 substances against C.a1bicans.Four be1ts on each side was Candida.a1bicans co1onies，and the midd1e b1ank was the zone of inhibition（Candida.a1bicans can not grow）

2.2 銅綠假單胞菌色素與抗菌作用：10株銅綠假單胞菌也因產色素不同，其抑菌效果也不一樣，產色素的菌株抑菌效果較好，不產色素的菌株抑菌效果較差，同時，產色素的菌株對不同念珠菌的抑菌效果也不一樣，6號和8號銅綠假單胞菌對白色念珠菌的抑菌率為100%，而平均抑菌帶最寬的是6號和9號菌株，見表2。

表2 產不同色素的10株銅綠假單胞菌對18株念珠菌的抑菌情況Table 2 Inhibition activity of 10 strains pigmented Pseudomonas.aeruginosa to 18 strains of Candida.albicans

3 討 論

念珠菌是人類的重要致病菌，目前深部念珠菌感染率在逐漸增高［5］，而白色念珠菌感染占第1位。2011年，Isibor等［6］報道在74份陰道標本培養中，共分離出致病菌84株，其中主要致病菌是白色念珠菌，共分離出35株，占47.7%；從孕婦分離出45株致病菌，其中白色念珠菌23株（51.1%）；從非孕婦分離出致病菌39株，白色念珠菌12株（30.8%）。2008年哥倫比亞的波哥大（Bogotá）三級保健中心用于靜脈給藥的塑料容器被念珠菌污染，發生18例白色念珠菌血流感染的暴發流行［7］。

銅綠假單胞菌對其他細菌有抑菌作用［1］。因此，我們利用臨床分離的10株銅綠假單胞菌對臨床分離的18株白色念珠菌進行了大批量抗菌活性研究，發現大多數銅綠假單胞菌對白色念珠菌的抗菌效果較好，通過180次試驗，敏感95次，抑菌率52.28%；對白色念珠菌的抑菌帶寬度最寬的可達44mm，抑菌帶幾乎占了平板（90mm）的一半，同時發現銅綠假單胞菌產色素的菌株抗菌效果好，不產色素的菌株抑菌效果較差。如產色素的5、6、8號菌株抑菌率達90%以上，甚至100%。

北愛爾蘭學者Kerr等［8］利用銅綠假單胞菌對白色念珠菌、熱帶念珠菌等各1株進行抑菌實驗，發現對白色念珠菌抗菌效果最好，但因菌株太少（僅1株），菌株之間又有差異，故不好說明抑菌效果。Bandara等［9］報道銅綠假單胞菌體外可抑制念珠菌的生物膜的形成，銅綠假單胞菌對細菌的抑制作用，主要是其產生綠膿素（pyocyanin）。綠膿素對細菌的抑制作用，主要是殺死細菌，綠膿素殺菌可能存在氧化或還原2種形式，后者是不穩定的與分子氧快速氧化的自由基，這種自身氧化作用導致超氧化物、過氧化氫形成，或在金屬催化劑（如鐵）存在下形成羥基原子團［hydroxy1 radica1（HOˊ）］而殺死敏感的細菌［10］。

Brand等［11］發現銅綠假單胞菌可以殺死白色念珠菌的菌絲，而不能殺死酵母細胞，殺死菌絲涉及直接接觸和可溶性因子（so1ub1e factors）介導2種調控模式，首先是銅綠假單胞菌黏附在活的白色念珠菌的菌絲上，第二步是定植（co1onization），定植后，銅綠假單胞菌產生不耐熱的可溶性因子，使菌絲的局部細胞壁溶解，內容物流出而菌絲死亡。

銅綠假單胞菌是引起人類燒傷感染、尿路感染、各種手術切口感染，以及器械相關性醫院感染的重要致病菌，甚至引起醫院感染的暴發流行［12-13］。銅綠假單胞菌不僅是人類的致病菌，引起人類的各種感染，另一方面，它產生的抗菌物質又能抑制其他致病菌生長。

總之，銅綠假單胞菌對白色念珠菌有很強的抑制作用，無疑為白色念珠菌等真菌感染的抗菌藥物研制開辟了一條新的途徑，將對人類的健康事業作出巨大貢獻。

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（本文編輯：趙麗潔）

STUDY OF IN VITRO INHIBITORY ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL SUBSTANCE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA AGAINST Candida ALBICANS

YANG Baoyou1，LI Zhongxing2*，QIN Jinxi3
（1.Department of Clinical Labolatort，the Hospital of Yutian Countt，Hebei Province，Yutian 064100，China；2.Department of Clinical Laboratort，the Second Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050000，China；3.Department
of Clinical Labolatort，the People's Hospital of Xushui Countt，Hebei Province，Xushui 072550，China）

Objective To observe in vitro inhibitory activity of antibacteria1 materia1 of Pseudomonas aeruginosa against Candida.a1bicans.MethodsThe in vitro inhibitory activity of antibacteria1 materia1 of Pseudomonas aeruginosa against 18 strains C andida.a1bicans，was detected by using the cross-streak assay.ResultsThe in vitro inhibitory activity of antibacteria1 materia1 of Pseudomonas aeruginosa against Candida.a1bicans，was exce11ent，and the inhibition rate of No.6，and 8 of Pseudomonas.aeruginosas against Candida.a1bican was 100%，the pigmented strains were found to have stronger antifunga1 activity than the unpigmented strains.Pseudomonas aeruginosa inhibited the growth of Candida.a1bicans main1y by producing pyocyanin.ConclusionAntimicrobia1 substances of Pseudomonas aeruginosa against Candida.a1bicans has strong antifunga1 activity.

pseudomonas aeruginosa；candida a1bicans；inhibitory activity

R738.991

A

1007-3205（2012）04-0425-04

2011-12-10；

2012-02-13

楊寶友（1968-），男，河北省玉田縣醫院副主任檢驗師，醫學學士，從事臨床細菌學研究。

*通訊作者。E-mai1：1zx_135@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.019