螺內酯對急性心肌梗死心肌細胞凋亡相關基因Bcl-2mRNA及BaxmRNA表達影響

許香梅，任曉敏，劉曙光，劉海云，王曉燕，董士民

（1.河北省石家莊市第一醫院心內科，河北石家莊，050011；2.河北省石家莊市供水醫院內科，河北石家莊，050021；3.河北省石家莊市橋東區休門衛生院內科，河北石家莊，050011；4.河北醫科大學第三醫院急診科，河北石家莊，050051）

螺內酯對急性心肌梗死心肌細胞凋亡相關基因Bcl-2mRNA及BaxmRNA表達影響

許香梅1，任曉敏1，劉曙光2，劉海云3，王曉燕1，董士民4

（1.河北省石家莊市第一醫院心內科，河北石家莊，050011；2.河北省石家莊市供水醫院內科，河北石家莊，050021；3.河北省石家莊市橋東區休門衛生院內科，河北石家莊，050011；4.河北醫科大學第三醫院急診科，河北石家莊，050051）

目的研究醛固酮受體拮抗劑螺內酯對心肌細胞凋亡相關基因Bc1-2mRNA及BaxmRNA表達的作用。方法結扎左冠狀動脈前降支制造大鼠左心室大面積心肌梗死模型。術后存活大鼠共72只，隨機分為心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）對照組（AMI組）、螺內酯（spirono1actone，Spi）治療組（Spi組）及假手術組（Sham組），每組24只。分別于術后48h，7、14、21d用PCR方法測定非梗死區心肌細胞Bc1-2mRNA和BaxmRNA的表達。結果與Sham組相比較，AMI組和Spi組大鼠非梗死區心肌細胞Bc1-2表達在48h，7、14、21d顯著降低（P＜0.01），BaxmRNA表達均顯著升高（P＜0.01）；與AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區心肌細胞Bc1-2和BaxmRNA基因表達在48h、7d差異無統計學意義（P＞0.05），14、21d時心肌細胞BCL-2基因表達均升高（P＜0.05和P＜0.01），BaxmRNA基因表達均顯著降低（P＜0.05和P＜0.01）。結論螺內酯可增加急性心肌梗死后大鼠非梗死區心肌細胞凋亡相關基因Bc1-2mRNA的表達和減弱BaxmRNA的表達。

心肌梗死；細胞凋亡；螺內酯

細胞凋亡是一種受多種基因調控的細胞自身程序性死亡［1］。研究［2-3］發現，心肌細胞凋亡是引起急性心肌梗死后心室重構的重要因素。長期大劑量使用血管緊張素轉換酶抑制劑治療產生所謂的“醛固酮逃逸現象”。因而醛固酮受體拮抗劑在心室重構中具有不可替代的作用。醛固酮受體拮抗劑可使心肌纖維化程度減輕，心肌順應性改善，心室肥厚逆轉。鑒于醛固酮對心室重構的影響，本課題通過急性心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）大鼠模型，探討醛固酮受體拮抗劑影響AMI后心室重構的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠AMI模型制作：結扎左冠狀動脈前降支制造大鼠左心室大面積AMI模型。大鼠稱質量，經

3%戊巴比妥鈉麻醉（40mg/kg腹腔內注射），并給予阿托品0.1mg/kg腹腔注射。作氣管插管，接小動物呼吸機（江西省特力麻醉呼吸設備公司生產）。取前胸正中切口，在3～4肋間進入胸腔，分離心包，從劍突下向胸腔方向及從兩側胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右心室流出道與左心房之間，距主動脈根部2～3mm處用絲線（7-0）穿過左冠狀動脈前降支，在心肌梗死組連同一小束心肌一起結扎，以心臟表面顏色即刻變化，術后心電圖J點抬高判斷造模成功。然后逐層關胸。撤掉呼吸機，自主呼吸平穩后，拔出氣管插管，逐層縫合。假手術組（Sham組）只穿線繞過冠狀動脈前降支而不結扎。術后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱質量，編號，按組分籠飼養。

1.2 分組和給藥方法：將術后48h存活的大鼠72只隨機分為Sham組、AMI對照組（AMI組，生理鹽水2mL·d-1灌胃）和螺內酯（spirono1actone，Spi）治療組（Spi組，螺內酯20mg·kg-1·d-1灌胃）。每組24只。

1.3 取材：3組分別于術后的48h，7、14、21d取材，用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開胸，取出心臟，冰上操作，4℃經高壓處理的DEPC水中洗去殘余血液，剪取左心室非梗死區心肌組織約100mg，立即液氮速凍后，于-80℃中保存，用于RT-PCR檢測。

1.4 觀察指標：用RT-PCR方法檢測大鼠非梗死區心肌組織Bc1-2mRNA和BaxmRNA表達，目的基因引物的合成，引物序列依據文獻報道設計，由上海生物工程公司合成。大鼠Bc1-2引物序列上游引物，5’-CAA GAA TGC AAA GCA CAT CC-3’，編號T12258，下游引物，5’-ATC CCA GCC TCCGTT ATC C-3’，編號T12259，PCR產物為702bp。大鼠Bax引物序列上游引物，5’-GGC TGG CAA GGC CTG GT-3’，編號T12057，下游引物，5’-AGC CAC AAA GAT GGT CAC TGT CT-3’編號T12058，PCR產物407bp。大鼠β-actin引物序列上游5’-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3’，下游5’-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3’，選自391～756bp，長為375個bp。提取大鼠心肌組織總RNA，并進行完整性檢測。合成cDNA第一鏈，目的基因的PCR擴增，用凝膠圖像分析系統（Ge1-Pro Ana1yzer Version 3.0）分析結果。

1.5 統計學方法：應用SPSS13.3軟件包進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 螺內酯對大鼠非梗死區心肌細胞 Bc1-2mRNA、BaxmRNA表達的影響：與Sham組相比較，AMI組和 Spi組大鼠非梗死區心肌細胞 Bc1-2 mRNA表達在 48h，7、14、21d均顯著降低（P＜0.01），Bax mRNA表達在48h，7、14、21d均顯著升高（P＜0.01）。與AMI組相比較，Spi組大鼠非梗死區心肌細胞Bc1-2mRNA表達在48h、7d差異無統計學意義（P＞0.05），14、21d均有所升高，分別升高15%（P＜0.05）、29%（P＜0.01）；BaxmRNA表達在48h、7d差異無統計學意義（P＞0.05），14、21d均有所降低，分別降低8%（P＜0.05）、30%（P＜0.01）。見表1，2。

表1 各組非梗死區心肌組織Bcl-2mRNA表達的變化（n=24，±s）

表1 各組非梗死區心肌組織Bcl-2mRNA表達的變化（n=24，±s）

*P＜0.01與Sham組比較 #P＜0.05 △P＜0.01與AMI組比較（q檢驗）

Bc1-2mRNA組別48h 7d 14d 21d Sham組0.77±0.04 0.76±0.04 0.77±0.02 0.79±0.02 AMI組 0.28±0.02* 0.30±0.06* 0.47±0.06* 0.52±0.04*Spi組 0.29±0.02* 0.32±0.05* 0.54±0.04*# 0.67±0.06*△

表2 各組非梗死區心肌組織BaxmRNA表達的變化（n=24，±s）

表2 各組非梗死區心肌組織BaxmRNA表達的變化（n=24，±s）

*P＜0.01與Sham組比較 #P＜0.05 △P＜0.01與AMI組比較（q檢驗）

BaxmRNA 組別48h 7d 14d 21d Sham組0.30±0.03 0.28±0.03 0.30±0.02 0.30±0.02 AMI組 0.89±0.04* 0.88±0.06* 0.69±0.03* 0.60±0.02*Spi組 0.90±0.05* 0.81±0.07* 0.64±0.04*# 0.42±0.05*△

3 討 論

3.1 AMI后心肌細胞凋亡相關基因Bc1-2mRNA和BaxmRNA表達的變化：研究［2］表明，心肌細胞凋亡是使心肌梗死范圍擴大的一個獨立因素。而細胞凋亡受多種基因、蛋白質、生長因子的調控，Bc1-2家族是目前研究最深入的調控因子之一。Bc1-2家族的成員能將準確地感受細胞所受到的刺激信號并整合，從而決定細胞是否凋亡［3］。本研究顯示，大鼠 AMI后在AMI組48h，7、14、21d非梗死區Bc1-2mRNA表達明顯降低，BaxmRNA表達明顯增加。表明在AMI后心肌細胞凋亡中Bc1-2家族起重要作用。可能機制為Bc1-2基因通過防止受損的DNA激活凋亡的誘導基因來防止細胞凋亡［4］。有研究［5］認為，Bc1-2家族的Bax同源二聚體導致線粒體Ca2+內流及細胞色素C外流的PTT交換通道，引起細胞凋亡。Bc1-2也可與Bax結合，Bax表達水平增加可拮抗Bc1-2的作用，促進細胞凋亡。Bc1-2也可能通過抗氧化作用或抑制氧自由基的產生抑制細胞凋亡。也有研究［6］認為Bc1-2基因是通過細胞內二磷酸鳥苷含量增加而實現抗凋亡的。Bc1-2與Bax調節細胞凋亡不僅取決于自表達的高低，而且還與Bc1-2/Bax比值有關，當比值減小時促進細胞凋亡，反之抑制細胞凋亡。

3.2 螺內酯對大鼠AMI后心肌細胞凋亡相關基因Bc1-2和Bax表達的影響：本研究顯示，Spi組與AMI組相比，隨時間的延長Bc1-2基因表達逐漸增加，Bax基因表達逐漸減低，提示螺內酯可能通過增加Bc1-2基因表達，減弱Bax基因表達，而抑制心肌細胞凋亡。本文通過從細胞凋亡相關基因表達來闡明其對心室重構的有益作用。螺內酯可減低Bax基因表達，增加Bc1-2基因表達，抑制心肌細胞凋亡，改善心室重構。可能機制為，降低醛固酮水平，減輕醛固酮所致的心室重構作用，醛固酮有不依賴血管緊張素Ⅱ的獨立作用，尤其是可以改善心室重構和血管重塑［7］；減低了血漿和心臟局部的醛固酮水平，從而減弱血管緊張素Ⅱ的效應，醛固酮受體拮抗劑通過降低心臟局部醛固酮水平下調AT1受體密度減弱血管緊張素Ⅱ的效應，從而減弱AngⅡ與AT1受體結合，通過激活三磷酸肌酸途徑減弱cfos、c-jun、c-myc等轉錄因子的表達，抑制心肌細胞凋亡，并降低由此介導的Bax基因表達水平，同時增加Bc1-2基因表達；減輕氧化應激，螺內酯通過減弱AMI后氧化應激，抑制應激活化蛋白激酶JNK（JNK是絲裂素活化蛋白酶家族主要成員之一）途徑引起細胞凋亡和Bc1-2基因表達減弱，使Bc1-2基因表達增加抑制細胞凋亡；抑制某些細胞因子表達，醛固酮受體拮抗劑通過抑制某些細胞因子（如腫瘤壞死因子-α［8］、轉化生長因子-β）表達而抑制細胞凋亡并增加Bc1-2表達，醛固酮受體拮抗劑通過減輕容量負荷而增加Bc1-2表達、降低Bax表達，抑制心肌細胞凋亡；螺內酯可減輕心肌損傷邊緣部位尚存心肌細胞早期凋亡，可能是通過改善心肌細胞線粒體功能，從而抑制細胞凋亡［9］。

大鼠AMI死后，非梗死區心肌細胞發生了凋亡，同時伴有凋亡相關基因Bc1-2的低表達及Bax的高表達；螺內酯治療可增加AMI后大鼠非梗死區心肌細胞凋亡相關基因Bc1-2的表達和減弱Bax的表達，從而減少心肌細胞凋亡，進一步抑制心室重構。

［1］ AGAH R，KIRSHENBAUM LA，ABDELLATIF M，et a1.Adenotra1 of E2F21 directs ce11 cyc1e reetry and P53-indep endent apoptosis in postmitotic adu1t myocardium in vivo［J］.J C1in Invest，1997，100（11）：2722-2728.

［2］ KAJSTURA J，CHENG W，REISS K，et a1.Apoptotic and necrotic myocyte ce11 deaths are independent contributing variab1es of infarct size in rats［J］.Lab Invest，1996，74（1）：86-107.

［3］ CHENG W，KAJSTURA J，NITAHARA JA，et a1.Programmed myocyte ce11 death affects the viab1e myocardium after infarction in rats［J］.Exp Ce11 Res，1996，226（2）：316-327.

［4］ MISAO J，HAYAKAWA Y，OHNO M，et a1.Expression of Bc1-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an acce1erator of apoptosis，inventricu1ar myocytes of human hearts with myocardia1 infarction［J］.Circu1ation，1996，94（7）：1506-1512.

［5］ DANIAL NN，GRAMM CF，SCORRANO L，et a1.BAD and g1uco-kinase reside in amitochondria1 comp1ex that integrates g1yco1ysis and apoptosis［J］.Nature，2003，424（6951）：952-956.

［6］ 成玲俐，馬虹，馬中富，等.急性心肌梗死心肌細胞中Bax和Bc122基因的mRNA表達量及其與凋亡的關系［J］.臨床心血管病雜志，2002，18（9）：1001-1439.

［7］ HAYASHI M，TSUTAMOTO T，WADA A，et a1.Re1ationship between transcardiac extraction of a1dosterone and 1eft ventricu1ar remode1ing：extracting a1dosterone through the heart promotes ventricu1ar remode1ing afteracute myocardia1 infarction［J］.J Am Co11 Cardio1，2001，38（5）：1375.

［8］ KROWN KA，PAGE MT，NGUYEN C，et a1.Tumor necrosis factor a1pha-induced apoptosis in cardiac myocytes.Invo1vement of the sphingo1ipid signa1ing Cascade in cardiac ce11 death［J］.J C1in Invest，1996，98（12）：2854-2865.

［9］ 趙文萍，張增祥，劉剛，等.螺內酯聯合ACE抑制劑等藥物長時間干預對大鼠心肌損傷后凋亡及其超微結構的影響［J］.醫學教育與研究，2009，26（1）：1-4.

（本文編輯：劉斯靜）

R542.22

B

1007-3205（2012）04-0431-03

2012-01-17；

2012-02-28

許香梅（1975-），女，河北大名人，河北石家莊市第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事心血管內科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.021