HPLC法測定抗骨增生片中柚皮苷含量

張智軍 崔 華 馬久太

(1彬縣食品藥品監督管理局，陜西省彬縣西大街老政府院內，713500;2陜西摩美得制藥有限公司;3陜西步長制藥有限公司)

抗骨增生片由熟地黃、鹿銜草、骨碎補、雞血藤、淫羊藿、肉蓯蓉、萊菔子等七味中藥組成，具有補腎、活血、止痛的功能，主治肥大性脊椎炎、頸椎病、跟骨刺、增生性關節炎、大骨節病，效果良好［1］。為了更好地控制產品質量，我們在其原質量標準的基礎上，對骨碎補中的有效成分柚皮苷進行了含量測定，并對方法學進行了研究，報道如下。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(島津LC-20AD);色譜工作站(島津LC-solution);紫外檢測器(島津SPD-M20A);電子天平(梅特勒-奧豪斯AR1140);超聲波清洗器(昆山KQ-250V)。

柚皮苷對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200809，供含量測定用);抗骨增生片(陜西摩美得制藥有限公司生產，批號050615、050616、050617);乙腈為色譜純;用水為重蒸水;其他試劑為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;檢測波長283nm;乙腈-水-冰醋酸(14∶86∶4)為流動相;流速 1.0mL·min-1;柱溫40℃;理論塔板數以柚皮苷計算應不低于2000。在此色譜條件下供試品分離度高，陰性無干擾。

2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細，取0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，回流提取60min，取出，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關系考察 精密稱取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1mL含7.1μg的溶液，搖勻，作為對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液 4、6、8、10、12、14μL，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，結果見表1。以C代表進樣量、A代表峰面積，計算回歸方程為 A=3325664.59C-7467.15，r=0.9999;柚皮苷在 0.0284～0.0994μg之間有良好的線性關系。

表1 柚皮苷線性關系考察結果

表2 精密度試驗結果

2.4 精密度試驗 精密吸取柚皮苷對照品溶液(7.1μg·mL-)10μL，按照上述色譜條件，注入液相色譜儀中，連續進樣6次，記錄峰面積，結果見表2。結果對照品溶液峰面積RSD為1.01%，表明本方法精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取樣品(批號050615)適量，制備供試品溶液，按照上述色譜條件，分別于 0、2、4、8、16h，注入液相色譜儀中，記錄峰面積，結果見表3。結果表明，供試品溶液峰面積在16h內RSD為1.72%，表明本方法穩定性良好。

表3 穩定性試驗結果

2.6 重現性試驗 取樣品(批號050615)適量，6份，制備供試品溶液，按照上述色譜條件，制備供試品溶液，按照上述色譜條件，注入液相色譜儀中，記錄峰面積，結果見表4。結果表明，樣品含量RSD為1.77%，表明本方法重現性良好。

表4 柚皮苷重現性試驗

2.7 回收率試驗 取樣品(批號050615)0.2g，各6份，精密稱定，同時加入樣品中含量80%、100%和120%的柚皮苷對照品，制備供試品溶液，按照上述色譜條件，注入液相色譜儀中，記錄峰面積，結果見表5。結果表明，平均回收率為98.76%，RSD為0.68%，表明本方法回收率良好。

表5 回收率試驗結果

2.8 樣品測定 按照上述方法制備供試品溶液，參照上述色譜條件操作，測定含量，結果見表6。藥品的質量，受藥材、設備、工藝等多種因素影響，根據3批抗骨增生片的含量測定結果，在其含量平均值0.66mg·g-1的基礎上，以70%轉移率計算，暫定抗骨增生片中柚皮苷含量限度為每1片不得低于0.66×0.4×70%=0.18mg，從而保證了產品的安全與有效。

表6 抗骨增生片柚皮苷含量測定結果

3 結論

1)骨碎補為抗骨增生片中的臣藥，柚皮苷為其主要有效成分，具有補肝腎強筋骨的作用，可促進骨損傷骨質生長、預防激素性骨質疏松、抗炎、鎮痛、降血脂作用、強心、鎮靜［2］。原質量標準中沒有含量測定項目，為了更好地控制產品質量，我們對骨碎補中的有效成分進行了含量測定。

2)柚皮苷含量測定方法有分光光度法［3］、薄層掃描法［4］、高效液相色譜法［5］等，本產品采用高效液相色譜法對抗骨增生片中的柚皮苷進行含量測定，結果平均回收率為98.76%，RSD為0.68%，方法靈敏、準確、重現性好。

3)實驗中［5-6］曾選用甲醇-醋酸-水(35:4:65)、乙腈-水-冰醋酸(20∶80∶4)、乙腈-水 -冰醋酸(14∶86∶4)為流動相，結果前2個條件未能達到滿意分離效果;后者分離度好，陰性無干擾，所以實驗最終選用后者為流動相。

試驗研究［7-8］中曾考察了柚皮苷的不同提取方法，結果以回流提取法＞索氏提取法＞超聲提取法，說明溫度較高條件下柚皮苷容易提取;同時回流提取60min，能夠將抗骨增生片中柚皮苷提取完全。

［1］抗骨增生片質量標準(標準編號WS3-B-1338-93).中華人民共和國衛生部部頒標準《中藥成方制劑》第七冊［S］.1993:74.

［2］陳順，關延彬.骨碎補藥理作用的研究進展［J］.醫藥導報，2006，25(7):685-687.

［3］范曉清，李雪婷，王沛.紫外分光光度法測定痛風寧微丸中柚皮苷的含量［J］.中國衛生工程學，2011，10(3):247-248.

［4］李曉光，林勵，陳志霞.薄層掃描法測定化橘紅中柚皮苷的含量［J］.浙江中醫學院學報，2003，27(1):82.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部［S］.北京:化學工業出版社，239.

［6］郭麗紅，鄭國鈞，苗愛東.高效液相色譜法測定解表清肺丸中柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(9):1493-1495.

［7］于宏偉，谷維娜，李娜.柚皮苷的提取方法及其應用研究進展［J］.湖北農業科學，2011，50(8):1516-1518.

［8］陳永剛，林勵，魏燕華.超聲波提取法與索氏提取法提取化橘紅柚皮苷的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19(4):309-311.