SDF-1/CXCR4的表達與喉癌組織VEGF-C表達、淋巴管生成及預后的相關性

王 瑩 李文媛 梁金花 丁 利 趙斯達

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，占耳鼻咽喉科惡性腫瘤7.9%～15.0%，近年來發生率呈顯著增長趨勢［1，2］。目前趨化因子受體(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)及其配體趨化因子基質細胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)相互作用形成的生物軸SDF-1/CXCR4在腫瘤轉移中的作用越來越受到人們的關注，研究發現SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌和口腔癌等多種惡性腫瘤的轉移中發揮重要作用，能夠促進腫瘤的血管生成，已成為腫瘤血管生成治療的一個新靶點，但關于SDF-1/CXCR4對腫瘤淋巴管生成的作用尚不明確［3］。血管內皮生長因子 -C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是目前最具代表性的淋巴管生成因子，通過激活淋巴管內皮細胞上的受體VEGFR-3可促進淋巴管內皮細胞增殖分化并誘導淋巴管生成。為此，本研究探討了SDF-1/CXCR4的表達與喉癌中VEGF-C表達、淋巴管生成和預后的關系，為喉癌的診治研究提供新的思路。

材料與方法

1.臨床資料:選取中國醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科2004年1月～2009年3月首次經手術治療的原發喉癌患者45例。女性43例，男性2例，平均年齡63.5歲。喉癌位于聲門上者17例，聲門者23例，聲門下者5例。按國際抗癌協會(UICC)1997年 TNM分期標準，T1N0M0 6例，T2N0M0 6例，T2N1M0 2例，T3N0M0 14例，T3N1M0 9例，T4N0M0 4例，T4N1M0 3例，T4N2M0 1例。有頸淋巴結轉移15例，淋巴管浸潤8例。隨訪至2009年6月1日，隨訪時間為3～71個月，平均31個月。死亡10例，其中呼吸困難2例，遠處轉移4例，其他疾病3例，原因不明1例。對照組20例，均為聲帶息肉手術切除病例。

2.主要試劑:二甲胂酸鈉，腺苷-5'-磷酸鈉，萘酚ASMX磷酸鈉，左旋咪唑，固藍BB鹽，二甲基甲酰胺(DMF)均購自美國SIGMA公司。SDF-1、CXCR4、VEGF-C抗體及 SP試劑盒均購自北京中杉公司技術有限公司。Trizol試劑、SuperscriptⅡ反轉錄酶、dNTPs購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標志物購自 Takara公司，SDF-1、CXCR4、VEGF-C和β-actin引物由大連寶生物合成。

3.免疫組織化學染色:嚴格按照免疫組化試劑盒說明的步驟進行，其中一抗濃度 SDF-1(1∶100)、CXCR4(1∶150)、VEGF-C(1:100)。以PBS代替一抗做陰性對照。評分標準按照細胞著色強度(無，0分;弱，1分;中，2分;強，3分)和切片中陽性細胞率評分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;＞50%，4分)之和為該病例評分值，將評分值≤2分定為陰性，≥3分定為陽性。

4.酶組化染色方法:采用王瑩等［4］報道方法進行酶組化染色方法(5'-Nase法)。淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LVD)定量分析:先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區域，在高倍鏡下計數5個視野淋巴管數，取其均值作為該切片淋巴管數。

5.統計學方法:應用SPSS 11.5統計軟件進行處理。計數資料采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman檢驗，兩組間LVD比較采用t檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C的表達情況:SDF-1、CXCR4和VEGF-C陽性表達位于細胞質和胞膜內，呈棕黃色顆粒狀(圖1～圖3)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C在喉癌組織中的陽性表達率分別為53.3%、35.5%和37.7%，在對照組中的陽性表達率分別為15%、10%和15%，均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.SDF-1、CXCR4和VEGF-C與臨床病理特征的關系及相關性分析:在各種臨床因素中，SDF-1和CXCR4蛋白表達均與TNM分期、淋巴結轉移、淋巴管浸潤密切相關(P＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤分化程度無相關性(P＞0.05)。VEGF-C蛋白表達與淋巴結轉移及淋巴管浸潤密切相關(P＜0.05)，但與年齡、性別、腫瘤部位、TNM 分期及腫瘤分化程度無相關性(P＞0.05)(表1)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C三者蛋白表達呈正相關(P＜0.05)(表2)。

3.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C與 LVD的關系:5'-Nase特異性地表達在喉癌組織中毛細淋巴管內皮細胞，在光鏡下可見呈棕黃色的點狀(橫切面)或條狀(縱切面，圖 4)，SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達均與瘤內和瘤周LVD密切相關(P＜0.05，表 3)。

4.生存率分析:按SDF-1、CXCR4表達的不同將喉癌患者分為兩組，［(-)為陰性，(+)為陽性］，Kaplan-Meier生存分析繪出喉癌患者整體生存曲線，CXCR4陽性表達平均生存時間為(52.8±6.1)個月，陰性表達組平均生存時間為(55.1±4.3)個月，Log rank檢驗表明CXCR4陽性表達與生存率不相關(χ2=0.284，P=0.498)。SDF-1 陽性表達平均生存時間為(28.5±4.8)個月，陰性表達組平均生存時間為(62.8±3.7)個月，Log rank檢驗表明SDF-1陽性表達生存率顯著低于陰性表達(χ2=11.175，P=0.001)(圖5)。

表1 SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達與喉癌臨床病理學特征的關系

表2 喉癌組織中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達的關系

表3 喉癌組織中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達與LVD表達的關系

圖5 喉癌患者整體生存曲線

討 論

SDF-1是骨髓基質細胞和成骨細胞所產生的CXC類趨化蛋白，CXCR4是目前已知SDF-1唯一的受體，近年來研究發現SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌和口腔癌中均能誘導高表達，其高表達與腫瘤細胞存活率和局部淋巴結轉移的增強及患者生存率降低有關［3］。本研究結果顯示SDF-1和CXCR4的蛋白在喉癌組織中表達顯著高于對照組，兩者表達均與TNM病理分期、淋巴結轉移、淋巴管浸潤密切相關。以上結果提示SDF-1/CXCR4生物軸能夠促進喉癌的發生發展及淋巴結轉移。Stephan Paget提出了“種子-泥土”假說，指出器官內在的特異性性狀與腫瘤的選擇性轉移有關［5］。因此我們推測，CXCR4陽性喉癌細胞(種子)可以有效地誘導SDF-1高表達的腫瘤微環境，進而誘導喉癌細胞淋巴管浸潤(泥土)，促進喉癌細胞的轉移。

最近有報道表明，SDF-1與CXCR4結合能夠上調血管內皮生長因子(VEGF)的表達，誘導腫瘤血管生成［6］。但SDF-1/CXCR4軸是否促進腫瘤淋巴管生成尚不清楚。許多研究報道已證實VEGF-C是目前最具代表性的淋巴管生成因子，其表達與多種人類腫瘤淋巴管轉移關系密切。本實驗發現，SDF-1/CXCR4與VEGF-C在喉癌組織中有過度表達，又都與淋巴管密度、淋巴結轉移和淋巴管浸潤等生物學特性相關，而且SDF-1/CXCR4與VEGF-C表達之間顯著正相關。由此推測SDF-1/CXCR4能夠通過誘導VEGF-C表達上調，促進喉癌淋巴管生成和淋巴管轉移，但其具體作用機制有待于進一步研究。

目前關于SDF-1和CXCR4表達對腫瘤預后影響的相關報道尚不多見，且爭議較多。Liu等［3］研究發現乳腺癌中CXCR4陽性表達與生存率相關，但Clatot等［7］研究發現SDF-1與頭頸部鱗狀細胞癌生存率密切相關，而CXCR4與生存率不相關。本實驗結果表明CXCR4陽性表達與生存曲線不相關，但SDF-1陽性表達生存率顯著低于陰性表達，與Clatot等觀察結果相一致。因此，檢測喉癌患者SDF-1蛋白表達將有望成為判斷喉癌預后的一個新指標。

1 常瑋，王斌全.RECK和MMP-9在喉鱗癌中的表達及其臨床意義［J］. 醫學研究雜志，2010，39(4):73-76

2 王瑩，李文媛，孫平，等.ET-1和VEGF-D的表達與喉癌組織淋巴管生成及預后關系［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18(11):575-579

3 Liu F，Lang R，Wei J，et al.Increased expression of SDF-1/CXCR4 is associated with lymph nodemetastasis of invasive micropapillary carcinoma of the breast［J］.Histopathology，2009，54(6):741-750

4 王瑩，李文媛，富澤龍，等.喉淋巴管的幾種組織化學顯色法比較觀察［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2008，17(1):70-73

5 Hirakawa S，Detmar M，Kerjaschki D，et al.Nodal lymphangiogenesis and metastasis:role of tumor-induced lymphatic vessel activation in extramammary Paget's disease［J］.Am J Pathol，2009，175(5):2235-2248

6 Shen X，Wang S，Wang H，et al.The role of SDF-1/CXCR4 axis in ovarian cancer metastasis［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(3):363-367

7 Clatot F，Picquenot JM，Choussy J，et al.Intratumoural level of SDF-1 correlates with survival in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2011，47(11):1062-1068