腦出血患者抵抗素基因+299G＞A 位點多態性分析

董曉巧 杜 權 俞文華 張祖勇 陳 雋 翁建豐 朱 強 車志豪

腦出血發病率高，預后差［1，2］。炎癥反應參與腦出血后繼發性腦損傷［3，4］。抵抗素是一種首先發現由白色脂肪細胞分泌的肽類激素，可表達于腦外傷及腦缺血動物腦皮質，參與炎癥反應［5～8］。我們最近研究發現，腦出血患者血漿抵抗素水平升高，且與預后顯著相關［9］。抵抗素基因內含子2區+299G＞A位點A等位基因的存在可以增加血液及組織中抵抗素的表達，從而影響其生物學效應，但其與腦出血相關研究少見報道［10，11］。本研究運用限制性內切酶方法，對抵抗素基因+299G＞A位點進行多態性分析，旨在揭示抵抗素基因+299G＞A位點多態性與腦出血炎癥反應的相關性，為腦出血繼發性腦損傷研究提供遺傳學基礎。

資料與方法

1．一般資料:腦出血病例為2007年1月～2009年12月杭州市第一人民醫院和慈溪市第二人民醫院神經外科收治的高血壓性基底節出血患者，共344例。對照組為同期杭州市第一人民醫院健康體檢者，共344例，年齡及性別均與腦出血病例配對。腦出血患者一般情況及臨床資料詳見表1。腦出血患者和對照組均除外既往腦卒中、使用抗凝劑、嚴重感染、嚴重心肝腎疾病及嚴重頭部外傷史。

2．指標測定:腦出血患者和對照組靜脈血在入院時或體檢時獲得。腦出血患者血標本立即放入無菌EDTA試管中，在4℃、1500r/min、離心20min收集血漿，儲存在 －70℃環境中待檢。ELISA法測定血漿抵抗素和C－反應蛋白濃度，試劑購于美國R＆D systems公司。

3．抵抗素基因+299G＞A位點多態性分析:使用美國Stratagene公司生產的DNA提取試劑盒提取腦出血患者及對照組外周血DNA，利用PCR－RFLP法分析抵抗素基因 +299G＞A位點基因多態性。根據人抵抗素基因特異序列設計引物:上游引物 5'－GGAAGAAGCCATCAATGAGAGG －3'，下游引物5'－CCTGTTGGTTTGGAGCTAGGTC－3'，擴增片段長度352bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增試劑盒為美國 MBI fermentas 公司生產，共 20μl，含 0．1mmol/L dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、MgCl22mmol/L、上下游引物各 0．25μmol/L、DNA模版約200ng。PCR反應條件:95℃ 變性7min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共循環35次，末次循環后72℃再延伸10min。取擴增產物3μl，用限制性內切酶AluⅠ酶(為美國NEB公司)5U對PCR擴增產物在37℃下酶切12h。將酶切產物點樣于瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結果、攝片，分析基因型。

4．統計學方法:采用SPSS 10．0統計軟件分析，計量資料行正態檢驗，正態分布數據以平均值±標準差(±+s)表示，行方差分析，非正態分布數據以中位數(上四分位數，下四分位數)表示，行Kruskal－Wallis H test檢驗，分類資料比較和Hardy－Weinberg平衡行卡方檢驗，數據相關性行Spearman相關分析和多元線性回歸分析，P＜0．05定為差異有統計學意義。

結 果

1．抵抗素基因 +299G＞A位點多態性分析:腦出血患者及對照組PCR產物均可見預期的352bp的片段。經限制性內切酶AluⅠ對PCR擴增產物進行酶切后產物電泳共獲得GG、GA和AA 3種基因型。對照組等位基因 G和 A的頻率分別為64．8%和35.2%，基因型GG、GA和AA的頻率依次為41.9%、45．9%和12．2%。腦出血患者等位基因G和A的頻率分別為69．3%和30．7%，基因型GG、GA和AA的頻率依次為49．1%、40．4% 和10．5%。經 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗，腦出血患者及對照組各基因型頻率均已達遺傳平衡，具有群體代表性。經卡方檢驗，腦出血患者及對照組各基因型差異無統計學意義(P=0．159)。

2．抵抗素基因 +299G＞A位點多態性與血漿抵抗素和C－反應蛋白水平的相關性分析:經方差分析，GG基因型患者血漿抵抗素均顯著低于GA和AA基因型患者(P=0．003，P=0．027)，而 GA 和 AA 基因型患者血漿抵抗素濃度差異無統計學意義(P=0.714);GG基因型患者血漿C－反應蛋白濃度均顯著低于 GA和 AA基因型患者(P=0．002，P=0.024)，而GA和AA基因型患者血漿C－反應蛋白濃度差異無統計學意義(P=0．766)(表1)。

3．血漿C－反應蛋白與抵抗素濃度的相關分析:Spearman相關分析顯示，血漿C－反應蛋白濃度與血漿抵抗素濃度(r=0．514，P ＜0．001)、格拉斯哥評分(r= － 0．425，P ＜ 0．001)、血糖(r=0．282，P ＜0.001)、血腫體積(r=0．397，P ＜0．001)、血肌酐激酶(r=0．118，P=0．028)、血纖維蛋白原(r=0．275，P ＜0．001)和 D － 二聚體(r=0．294，P ＜0．001)均呈顯著相關性。多元線性回歸分析顯示，血漿C－反應蛋白濃度與血漿抵抗素濃度(t=7．032，P＜0．001)和格拉斯哥評分(t= －4．845，P＜0．001)仍顯著相關性。

表1 腦出血患者+299G＞A基因型之間腦出血相關指標的比較

討 論

腦出血后繼發性腦損傷的病理生理機制復雜，涉及很多方面。炎癥反應是腦出血后繼發性腦損傷的重要組成部分。腦出血后，補體、凝血酶和纖維蛋白降解產物等可誘發一系列炎癥反應，從而白介素－6、白介素－10、腫瘤壞死－α等許多炎癥因子濃度升高，血腦屏障通透性增加，腦水腫加重，導致神經細胞凋亡，加重腦損傷［3，4］。

抵抗素是一種主要由白色脂肪細胞分泌的肽類激素，與Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、肥胖、脂質代謝異常等有關［12～14］。近年來研究表明抵抗素在外周血單核細胞中高表達，并與多個炎性標志物相關，提示抵抗素是一種前炎性細胞因子，可能以一種代謝信號的方式表達潛在的炎性作用，引起多系統炎性相關性疾病［5，6，12～14］。在小鼠缺血腦損傷中，損傷同側大腦皮質和海馬區抵抗素表達明顯增加［7］。在大鼠創傷性腦損傷中，損傷同側和對側海馬區抵抗素mRNA水平顯著增加［8］。我們研究發現，腦外傷及腦出血患者血漿抵抗素水平升高，且與預后顯著相關［9，15］。最近研究發現，腦外傷患者血漿抵抗素濃度和超敏C－反應蛋白顯著相關。本研究亦發現，血漿抵抗素濃度與C－反應蛋白濃度顯著相關。這些提示，抵抗素在腦損傷后炎癥反應中具有重要角色。

人抵抗素基因定位于19p13．2，其mRNA含476個堿基對，其編碼區含有326個堿基對，編碼108個氨基酸。國內外學者通過基因篩查發現抵抗素有30個多態性位點，其中內含子區17個，啟動子區5個，外顯子區8個，其中抵抗素基因內含子2區 +299G＞A位點多態性可以影響血液及組織中抵抗素的表達，從而影響其生物學效應，血清抵抗素水平在AA基因型表達最高，其次 GA 型，GG 型表達最少［10，11］。抵抗素+299G＞A基因多態性可能與2型糖尿病易感性相關［11］。本研究發現抵抗素基因+299G＞A位點單核苷酸多態性與腦出血無顯著相關性。同時，本研究腦出血患者各基因型組間一般資料、臨床資料及常規化驗結果等混淆因素差異無統計學意義，進而分析發現抵抗素基因+299G＞A位點多態性與腦出血患者血漿抵抗素濃度顯著相關。有趣的是，我們也發現抵抗素基因+299G＞A位點單核苷酸多態性與腦出血患者血漿C－反應蛋白濃度顯著相關。這些提示，抵抗素基因+299G＞A位點單核苷酸多態性可能參與腦出血后的炎癥反應。

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