繆刺電針足三里穴、陽陵泉穴對CCI 大鼠背根神經節P2X3受體表達的影響

操 芬 屠文展 程瑞動 程 博 蔣松鶴

三磷酸腺苷(adenosine 5'－triphosphate，ATP)已經被證實具有神經遞質或調質作用，P2X3受體是ATP受體的一種亞型，屬配體門控型離子通道，可表達于初級傳入神經元的胞體、中樞端和外周端，參與初級感覺神經元的痛覺及傷害性信息傳遞［1～3］。神經病理痛和炎性痛刺激時，P2X3受體蛋白和mRNA表達增加，感覺神經元P2X3受體介導ATP激活的門控通道電流明顯增強［4］。

繆刺為左病取右，右病取左的針刺方法，始見于《黃帝內經》，多用于中風偏癱、軟組織損傷及諸多疼痛癥。臨床上，繆刺足三里穴、陽陵泉穴常用于治療腰腿痛，療效顯著，在動物實驗研究也發現針刺大鼠足三里穴、陽陵泉穴具有累積鎮痛效應［5，6］。針刺的鎮痛機制復雜，Goldman等［7］研究發現針刺大鼠足三里穴后，穴位周圍ATP及其代謝產物腺苷等濃度明顯增高。因此嘌呤類物質及其受體和針刺鎮痛之間的聯系引起了學者們的關注。Xiao等［8］研究證明電針坐骨神經慢性縮窄性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)大鼠造模側足三里穴可引起CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾升高及中腦導水管周圍灰質外側部P2X3受體表達升高。然而繆刺電針足三里穴、陽陵泉穴對大鼠背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)P2X3受體表達的影響尚未見報道。本實驗采用CCI模型大鼠，通過繆刺電針和患側電針足三里穴、陽陵泉穴，觀察大鼠造模側機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawal latency，TWL)的變化及P2X3受體蛋白在L4～L6DRG神經元上的表達變化，旨在探討P2X3受體在繆刺電針抗慢性神經病理性疼痛中的作用。

材料與方法

1．主要試劑和儀器:兔抗大鼠 P2X3多克隆一抗(美國Millipore公司AB5895)，HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司 A0208)。336爪/尾刺激痛覺測試計以及2390 Electrovonfrey測痛計購自美國ⅡTC公司。

2．動物分組及CCI模型制備:清潔級健康成年雄性SD大鼠32只，由溫州醫學院實驗動物中心提供，體重170～200g，隨機分為4組:假模組(只暴露坐骨神經，不結扎不電針)、模型對照組(右側后肢造模不電針)、繆刺電針組(右側后肢造模后電針左側足三里穴，陽陵泉穴)、患側電針組(右側后肢造模后電針右側足三里穴，陽陵泉穴)，每組8只。

除假模組外，其余3組按Bennett等［9］模型制備方法建立大鼠CCI模型，5%水合氯醛(0．6ml/100g體重)腹腔注射麻醉，大鼠右側后肢股去毛備皮，常規消毒，沿右股骨下緣切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，用4-0可吸收鉻制羊腸線在坐骨神經分叉前打4個間隔1mm的松結，使神經外膜稍稍受壓，松緊度以股肌肉或足指輕微抽動為度。假模組大鼠僅暴露坐骨神經2～3min，不打結，其余手術操作相同。CCI模型制備后大鼠出現跛行，足呈輕度外翻狀，且有時出現舔舐、懸空等后肢保護現象，表明坐骨神經慢性擠壓傷模型制備成功。造完模后，各組大鼠分籠飼養，自由飲食，室溫22±2℃，相對濕度50% ～70%。

3．電針方法:CCI術后第8天，將大鼠固定于自制改良的大鼠針刺固定器，暴露針刺側肢體，相應部位去毛備皮，安靜后用3mm皮內針，針刺足三里穴，陽陵泉穴(取穴標準按郭義主編的《實驗針灸學》［10］:足三里穴在膝關節下腓骨小頭下方約5mm處;陽陵泉穴在膝關節下方，腓骨小頭前下方凹陷處)，垂直進針3mm，用膠布局部固定，防止脫出。采用韓氏治療儀，2/100Hz交替脈沖連續刺激，每種波形持續2.5s，電流強度1mA(以腿部肌肉輕微抽動為度)，持續30min，每日同一時段連續電針7天。假模組和模型對照組不予電針處理。

4．行為學測定:(1)機械縮足反射閾值(MWT):將大鼠置于透明的有機玻璃箱中，底為1cm×1cm的鐵絲網，待大鼠安靜后，用2390 Electrovonfrey測痛計的電子壓力傳感器探頭由下向上刺激大鼠右側后肢足底中部皮膚，垂直向上均勻緩慢增加力度至大鼠右后肢抽動或抬足逃避，記錄此時電子顯示器上的數值(單位g)。測定時間為術前1天及術后3、5、7、10、12、14天，每次測定重復5次，間隔5min，取5次平均值。(2)熱縮足反射潛伏期(TWL):將大鼠置于底為3mm厚玻璃板的有機玻璃箱中，待大鼠在安靜后，用336爪/尾刺激痛覺測試計的燈光照射大鼠右后肢足底中部皮膚。熱輻射刺激儀參數設定:加熱頭空閑時激光發射強度為20%，加熱頭測試工作時激光發射強度為60%，切斷時間25s以防測試時間過長對動物造成損傷，觸發溫度30℃。待大鼠右后肢抬起逃避時，切斷熱源，記錄此時的照射時間(s)。測定時間為術前1天及術后 3、5、7、10、12、14 天，每次測定重復 5 次，間隔10min，取5次平均值。

5．Western blotting法檢測P2X3受體蛋白表達:術后第14天，腹腔注射10%水合氯醛(0．4ml/100g)麻醉后，冰上取L4～L6 DRG用于P2X3受體蛋白檢測。在冰上將L4～L6 DRG加組織裂解液(用Western及IP裂解液和PMSF配制，比例為99∶1)研碎，充分裂解，4℃，12000r/min×5min離心取上清，用BCA法測定蛋白濃度。各樣本按60μg/15μl蛋白上樣，70V和120V電泳后300mA濕轉40min，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST 漂洗 3×5min，P2X3一抗(1∶1000)4℃ 孵育18h，TBST漂洗3×10min后室溫下HRP標記山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育1h，TBST 漂洗 3 ×10min，滴加 ECL 顯色，DNR Micro Chemi化學發光凝膠成像系統成像。

6．圖像分析及數據處理、統計學方法:Alpha Ease FC(Fluorchem FC 2)軟件對Western blotting實驗結果進行半定量分析，結果以P2X3受體蛋白和內參Actin平均光密度值的比值表示該蛋白的相對表達水平，所得數據均用平均值±標準差±s)表示，采用SPSS 16．0統計軟件分析，痛閾數據用重復測量的兩因素方差分析處理，平均光密度值的比值采用單因素方差分析后進行LSD檢驗。以P＜0．05表示差異有統計學意義。

結 果

1．CCI模型大鼠行為學觀察:CCI術后第1天大鼠出現行走時患肢拖動，不能抬離地面，跛行，安靜時足呈輕度外翻狀，足趾不能承重或以膝關節承重，且有時出現舔舐、懸空等后肢保護現象，日常活動及梳理皮毛動作明顯較假模組減少。

假模組大鼠術前與術后比較，MWT和TWL無明顯差異。與假模組相比，CCI術后各組大鼠在各時間點MWT和TWL明顯降低(P均＜0．001)，其中模型對照組大鼠的MWT和TWL緩慢下降至術后第14天。電針治療后，繆刺電針組和患側電針組大鼠MWT和TWL均有不同程度的持續升高，與模型對照組相比差異顯著(P均＜0．05)。術后第14天，繆刺電針組和患側電針組相比無明顯差異(P＞0．05、圖1、圖 2)。

2．大鼠CCI術后L4～L6 DRG神經元上P2X3受體蛋白表達變化:Western blotting分析結果提示，在4個實驗組中均觀察到在分子質量48kDa處有免疫陽性條帶，與已知的P2X3受體蛋白分子質量符合。以Actin作為內參蛋白，采用相對光密度值定量檢測結果。CCI術后第14天，與假模組比較，3組大鼠造模側L4～L6 DRG神經元上P2X3受體蛋白表達上調(P均＜0.05)。經電針干預7天后，繆刺電針組和患側電針組大鼠造模側L4～L6 DRG神經元中P2X3受體蛋白表達均減少，與模型對照組比較，差異有統計學意義(P均＜0．001)。繆刺電針組與患側電針組相比，L4～L6 DRG神經元中P2X3受體蛋白表達差異無統計學意義(P ＞0．05，圖3、圖4)。

討 論

1．足三里穴、陽陵泉穴的解剖及信號傳導:足三里屬足陽明胃經，陽陵泉屬足少陽膽經，二者解剖部位臨近，均在腓骨小頭附近，是臨床上治療坐骨神經痛常用的兩個穴位。《針灸學》［11］中記載:足三里在外膝眼下3寸，脛骨前嵴外一橫指處，穴深層為腓深神經;陽陵泉在腓骨小頭前下方凹陷中，為足少陽膽經合穴，局部解剖正當腓總神經分為腓淺神經和腓深神經處，這些神經正是坐骨神經的分支。樓新法等［12，13］研究發現，足三里穴有一個神經小分支和小血管密集區，位于脛骨前肌與骨間膜之間的疏松結締組織內，并認為針刺足三里穴區能通過腓深神經和脛前動脈壁上的神經叢上傳針刺信號，直刺陽陵泉略向下即可刺中腓總神經分支其附近。在臨床研究中，趙敏生等［14］采用辣根過氧化物酶(CT－HRP)追蹤到大鼠左側足三里穴投射到脊髓的T12～S2節段，以L5～S2的標記最多，本實驗的取材正是 L4～L6 DRG，與足三里穴的投射區相吻合。

2．繆刺:繆刺是臨床常用的交叉取穴針刺方法，《黃帝內經》中記載:“夫邪客大絡者，左注右，右注左，上下左右，與經相干，而布于四末，其氣無常處，不入于經俞，命曰繆刺”。可見，繆刺是一種左病治右，右病治左的取穴方法。目前，學者們對繆刺取穴的作用機制已進行了探索，臨床上，肖葉玉等［15］通過磁共振功能成像研究表明直刺右側足三里可引起腦雙側多個功能區的激活。周誠等進行了針刺陽陵泉穴fMRI腦功能成像的研究，結果顯示針刺陽陵泉穴，同側枕葉視皮質有明顯興奮區，雙側枕葉視皮質都有明顯興奮區。動物實驗研究也發現繆刺法對佐劑性關節炎大鼠有較好的鎮痛效應。

本實驗研究發現繆刺電針組和患側電針組造模側L4～L6 DRG神經元上P2X3受體的表達均降低，與模型對照組相比均有顯著差異 (P＜0．001)，而繆刺電針組與患側電針組比較P2X3受體表達無明顯差異 (P＞0．05)，且電針7天后大鼠 MWT和 TWL均有不同程度的持續升高，繆刺電針組和患側電針組相比無明顯差異。這一結果提示繆刺電針和患側電針均能下調CCI大鼠造模側L4～L6 DRG上P2X3受體表達，減輕CCI大鼠機械性痛覺過敏和熱痛覺過敏，考慮此結果的可能機制為繆刺電針和患側電針的針刺信號均能通過DRG傳導至脊髓，再上行至脊髓上中樞，如下丘腦、中腦導水管周圍灰質、大腦皮質等，引起腦內雙側多個功能區的激活，從而對傷害性刺激引起的反應進行調制，降低造模側L4～L6 DRG上P2X3受體表達，從而起到鎮痛作用。

3．DRG神經元中P2X3受體和疼痛傳導的關系:DRG作為痛覺傳入的第一級神經元，在痛覺的外周機制中起著極為重要的作用。疼痛信號由DRG初步加工后傳入脊髓，再經多條傳導束向高級中樞傳遞，最后到達大腦皮質。DRG神經元中不僅含有傳遞傷害性感覺的神經遞質和調質，如速激肽、興奮性氨基酸等，也含有起突觸前調制作用的受體，如γ氨基丁酸(GABA)、阿片、嘌呤等受體，以及一些離子通道。這些物質在疼痛的發生機制中起重要作用。劉曉紅等研究表明坐骨神經縮窄性損傷致神經痛后同側對應節段的背根節神經元P2X3受體表達明顯增加，ATP快反應電流明顯增強。本實驗研究結果發現，模型對照組造模側L4～L6 DRG神經元上P2X3受體蛋白表達量與假模組相比顯著升高，與以往研究報道相一致。

本實驗的研究結果提示繆刺電針和患側電針刺激大鼠“足三里、陽陵泉”穴均可下調CCI大鼠造模側L4～L6 DRG神經元上P2X3受體表達，為針刺鎮痛機制的進一步研究和針刺鎮痛的臨床運用提供了參考。

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