洛伐他汀自組裝前體脂質體的制備及其理化性質的研究

孫川棣，劉建平

中國藥科大學藥劑研究所，南京 210009

他汀類（statins）藥物是目前國內外研究最多也最具前途的降血脂藥物。目前臨床較常用的他汀類藥物有：洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀等。其中辛伐他?。╯imvastatin）由美國默克公司開發，1991年獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準[1]。普伐他?。╬ravastatin）由日本三共株式會社研究成功后于1989年率先在日本上市。洛伐他汀（lovastatin）是第一個獲美國FDA批準上市的他汀類藥物,它主要用于治療原發性高膽固醇血癥和以高膽固醇異常為主的高脂血癥，還可防治冠狀動脈粥樣硬化、延緩硬化進程，并減少梗塞病的發生。其獨特的療效，被譽為治療心血管系統疾病的里程碑，深受廣大患者的歡迎[2]。

目前臨床上使用的洛伐他汀以片劑和膠囊劑等口服制劑為主，如Merck公司的系列產品[3-5]Lovalip?、Mevacor?、Mevinacor?、Mevlor?以及 Sidus公司的Sivlor?。國內也研制了洛伐他汀的普通片，主要品種有羅華寧?、美降脂?、美降之?等，其他上市的還有滴丸、緩釋片、膠囊[6]。但由于其水溶性差，口服吸收率僅為31%，存在肝首過效應[7]，體內消除半衰期僅為3 h左右，屬于短半衰期藥物，口服生物利用度低，有胃腸道不適、腹瀉、脹氣等常見不良反應[8]，這些給預防用藥的患者和大多數慢性心血管病患者帶來了諸多不便。

脂質體作為新型的載體給藥系統，具有生物膜特性和藥物傳輸能力，將難溶性藥物包裹在脂質雙分子層中，使其具有較強的兩親性,可以顯著提高藥物的口服跨膜吸收率及體內生物利用度[9-10]。本研究以洛伐他汀為模型藥物，制成洛伐他汀自組裝前體脂質體（self-assemble proliposomes），克服了普通脂質體在貯存期間易發生聚集、融合及藥物滲漏等穩定性問題；同時，洛伐他汀自組裝前體脂質體制備工藝簡單，易于擴大化生產，省去了固體型前體脂質體除去有機溶劑的步驟，解決了其水合過程中存在的水合速度較慢、分散不均勻等問題。目前尚未見洛伐他汀脂質體口服制劑報道，此研究為提高洛伐他汀的生物利用度，開發口服洛伐他汀脂質體制劑，使其更好地發揮臨床療效奠定了基礎。

1 試劑與儀器

洛伐他?。〒P子江藥業惠贈）；洛伐他汀對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：100600-200502）；大豆磷脂(上海太偉藥業有限公司，批號：100819)；膽固醇（Sigma 公司，批號：MKBD9096V）；去氧膽酸鈉 （國藥集團化學試劑有限公司,批號：F20100607）；Sephadex G-50（Pharmacia 進口分裝）。PEG400（西隴化工股份有限公司，CP）；無水乙醇（南京化學試劑有限公司，分析純）。

UV-2000紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；日立H-7650透射電鏡（日本日立公司）；Zetasizer 3000HSA粒徑測定儀 （英國Malvern公司）。

2 方法與結果

2.1 洛伐他汀自組裝前體脂質體的制備

大豆磷脂為膜材,無水乙醇、PEG-400為分散介質，將處方量洛伐他汀直接溶解于含有大豆磷脂、PEG-400的無水乙醇溶液中，再加入適量修飾劑A（即伯洛沙姆）、膽固醇、去氧膽酸鈉，溶解制成前體脂質體澄明溶液后，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即制成洛伐他汀自組裝前體脂質體。取洛伐他汀前體脂質體少量，加入水合介質振搖得白色混懸液，即得到洛伐他汀脂質體。

2.2 洛伐他汀的分光光度分析方法

精密稱取干燥至恒重的洛伐他汀適量于量瓶中，經無水乙醇定容后稀釋到質量濃度為100 μg·mL-1的儲備液。精密吸取儲備液適量至10 mL量瓶中，分別用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻得濃度為2、4、8、12、16 μg·mL-1的洛伐他汀溶液，以無水乙醇空白作對照，分別于238 nm處測定吸收度值，以濃度（C）對吸收度值（A）線性回歸得標準方程。洛伐他汀含量的線性回歸方程為：C=16.01A+0.1726，r=0.9999，線性范圍：4～16 μg·mL-1。 高、中、低 3 個濃度的平均回收率分別為99.92%、99.54%及99.59%,日內及日間精密度RSD均＜2%,均符合要求。因在238 nm處輔料對藥物測定有干擾，每次測定需制備空白脂質體用無水乙醇定容并測定吸收值，從總吸收值中扣除輔料的吸收值[11]。

2.3 正交實驗處方篩選

采用正交試驗篩選前體脂質體的處方，選擇藥物∶磷脂（A，1∶20、1∶18、1∶15）、磷脂∶修飾劑 A（B，3∶1、2.5∶1、2∶1）、 磷脂∶膽固醇 （C，20∶1、10∶1、5∶1）3 個因素，每個因素3個水平，以水合后的包封率為指標，用L9（34）正交試驗表研究輔料用量對前體脂質體物理特性的影響，篩選和優化前體脂質體的處方。實驗結果表明，各因素主次順序為：C＞B＞A，最優方案是 A2B1C1。故最優處方為：藥物∶磷脂為 1∶18，磷脂∶修飾劑 A 為 3∶1，磷脂∶膽固醇為 20∶1。

2.4 脂質體的質量評價

2.4.1 脂質體形態取洛伐他汀前體脂質體分別用蒸餾水和人工胃液水合，所得脂質體混懸液滴至專用覆蓋碳膜銅網上，靜置5 min，用2.0%磷鎢酸鈉負染液染色，室溫自然晾干，然后用日立H-7650透射電鏡觀察。結果如圖1所示，A圖和B圖中都可見脂質體為圓球或近圓球形，且具有明顯的指紋特征，說明洛伐他汀前體脂質體在水中和人工胃液中都能成功自組裝成為脂質體。

圖1 洛伐他汀脂質體透射電鏡圖

2.4.2 粒徑和Zeta電位取水合后脂質體混懸液用蒸餾水適當稀釋，用Zetasizer 3000HS激光粒度儀測定粒徑和Zeta電位。結果表明，洛伐他汀脂質體的平均粒徑為 （327.4±29.6）nm，多分散系數為0.447±0.102，Zeta電位為-（22.40±1.5）mV， 表明脂質體粒子表面荷負電，在一定程度上阻止了粒子聚結，從而保證了脂質體混懸液的物理穩定性。

2.4.3 微柱離心法測定洛伐他汀脂質體的包封率

2.4.3.1 洗脫曲線 采用微柱離心法分離脂質體與游離藥物，取5 mL塑料注射器，去芯，底部塞入脫脂棉，裝入預先用蒸餾水浸泡的葡聚糖凝膠，柱高約 5 cm，1000 r·min-1離心 2 min除去過量的蒸餾水，得到葡聚糖凝膠微柱。

精密吸取水合的洛伐他汀脂質體0.4 mL，緩緩加于柱頂部，1000 r·min-1離心2 min收集濾液，再于柱頂部加入相同體積的蒸餾水，相同條件下離心，重復上述操作，分別收集每次離心所得的濾液，用無水乙醇定容至10 mL，測定吸收度后計算藥物濃度，繪制洗脫曲線，結果見圖2。由圖2可知，脂質體在前2 mL洗脫完畢，游離藥物后被洗脫下來，脂質體和游離藥物分離良好。

圖2 洛伐他汀脂質體包封率測定的洗脫曲線

2.4.3.2 包封率測定 按“2.4.3.1”項下制備葡聚糖凝膠微柱，取水合的洛伐他汀脂質體0.4 mL緩慢滴加到柱床上，將微柱放入干凈的離心管中，1000 r·min-1離心2 min，連續洗脫3次，合并所收集的濾液，無水乙醇定容后測定吸收度，計算得到已包封藥物濃度 （C1）；另取水合后的洛伐他汀脂質體0.4 mL，加入無水乙醇定容，檢測總藥物濃度（C0）；包封率（E）=C1/C0×100%。3批樣品中洛伐他汀的平均包封率為95.4%±6.7%。

2.4.4 洛伐他汀脂質體的自組裝速度的測定類脂在水性介質中所形成膠體溶液的分散程度可通過測定其濁度（τ）的變化來評價，當類脂在水性介質中分散形成均一體系時，體系的濁度幾乎達到坪值，不再發生明顯的變化。由于膠體溶液的濁度（τ）與其吸光度（A）呈正相關[12]，因此可通過測定洛伐他汀前體脂質體自組裝過程中吸收度的變化來評價其自組裝的速度和程度。具體方法為：使用人工胃液配對，在樣品池中加入3 mL人工胃液，用微量進樣針在液面下快速注入前體脂質體，反復振搖，在600 nm處快速測定吸收度，每份樣品測定3次，最高點時間和穩定時間的吸收度取平均值，以此考察洛伐他汀前體脂質體在水合介質中的自組裝速度，結果見圖3。從圖3可見，吸收度在60 s左右不再變化，說明洛伐他汀自組裝前體脂質體在60 s內形成脂質體，并達到分散平衡。

圖3 洛伐他汀前體脂質體自組裝速度

2.4.5 滲漏穩定性分別取洛伐他汀前體脂質體于不同量人工胃液中水合形成不同稀釋倍數的洛伐他汀脂質體溶液（50倍、100倍），并將此脂質體于 4℃放置 0、2、4、6、8、12 h 后測定包封率，以放置后的藥物包封率與初制備時的包封率相比，考察脂質體滲漏率。結果見表1。由表1可見，與0 h相比，洛伐他汀脂質體在4℃放置12 h后，包封率變化不大，說明藥物滲漏較少，脂質體較穩定。

表1 洛伐他汀脂質體的滲漏穩定性

2.4.6 粒徑穩定性取一定量的洛伐他汀自組裝前體脂質體注入人工胃液中形成自組裝洛伐他汀脂質體，于 0、1、2、3、4、5、6、8、12 h 測定粒徑大小，以不同時間點的粒徑大小對時間作圖，評價洛伐他汀脂質體在水合介質中的粒徑穩定性。由圖4可見，不同時間水合后，脂質體粒子粒徑變化不大，預示前體脂質體進入體內后同水分逐漸接觸的過程中，脂質體粒子不會發生聚結、融合。

圖4 洛伐他汀脂質體的粒徑穩定性

3 討 論

前體脂質體在一定程度上克服了傳統脂質體易聚集、融合及藥物滲漏等不穩定問題，但在制備固體型前體脂質體過程中，因其工藝復雜，成本高，難以用于臨床，且固體型前體脂質體水合過程也存在水合速度較慢、局部溶解不完全、分散不均勻等問題，從而導致藥物包封率和粒徑等主要質量指標不易有效控制，故難以滿足臨床使用要求，至今尚無該類制劑上市。本文采用一種新型前體脂質體制備方法，此法簡便易行，在水合過程中不必采用勻化技術或機械，即可快速自組裝成為包封率高的含藥脂質體，同時避免了以往固體型前體脂質體制備中有機溶媒的去除過程。本法制備的自組裝前體脂質體在貯存過程中為無水狀態的澄明液體，是一種動力學穩定體系,有效解決了脂質體的穩定性問題，這為脂質體真正走向市場開拓了新途徑。

采用本文的前體脂質體制備方法得到的洛伐他汀前體脂質體可快速自組裝形成含藥脂質體，且脂質體包封率較高。滲漏和粒徑穩定性實驗表明脂質體具有良好穩定性。

本文將洛伐他汀制成新型前體脂質體，并初步考察了制備洛伐他汀前體脂質體的可行性。洛伐他汀前體脂質體的體內動力學特征、分布、代謝等情況，仍需進一步考察。

[1] 馮志英，胡容峰，孫玉亮，等.辛伐他汀自乳化釋藥系統處方優化及Beagle犬體內藥代動力學 [J].中國藥科大學學報，2009，40（2）：131-4.

[2] Blumenthal RS.Statins effective antiatherosclerotic therapy[J].Am Heart J,2000,139(4):577-83.

[3] Tobert JA.Lovastatin and beyond:the history of the HMG-CoA reductase inhibitors[J].NatRev Drug Discov,2003,2(7):517-26.

[4] Lee KE,Cho SH,Lee HB,et al.Microencapsulation of lipid nanoparticles containing lipophilic drug [J].J Microencapsul,2003,20(4):489-96.

[5] Pflaum,Zlatko,Salobir,etal.Solid pharmaceutical formulation containing Lovastatin and simvastatin,respectively,and its preparation:USPTO,657853[P].2000-09-08.

[6] 錢 進，許 軍，彭 紅，等.洛伐他汀滴丸及其制備方法：中國，200310100910.9[P].2004-09-15.

[7] 金有豫.他汀類調脂藥的藥理學基礎[J].臨床藥物治療雜志，2005，3（3）：1-4.

[8] 李東寶，華 琦.他汀類藥物的安全性[J].中華內科雜志，2002，41（5）：350-2.

[9] Xiao YY,Song YM,Chen ZP,et al.Preparation of silymarin proliposomes and its pharmacokinetics in rats[J].Acta Pharm Sin，2005，40(8):758-63.

[10] Tian YY,Ge L,Duan XL,et al.Lycopene liposomes:lycopene release in vitro and pharmaceutical behaviors and antioxidation in vivo[J].Acta Pharm Sin,2007,42(10):1107-11.

[11] 陳斯澤.鹽酸洛拉曲克長循環脂質體的制備及其抑瘤特性研究[D].廣東：第一軍醫大學，2006.

[12] Matsuzaki K,Murase O,Sugishita K,et al.Optical characterization ofliposomes by rightangle light scattering and turbidity measurement [J]. Biochim Biophys Acta,2000,1467(1):219.