β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的研究和檢測方法進(jìn)展

侯玉榮 ，袁耀佐 ，張 玫 ，錢 文 ，杭太俊

1中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；2江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，南京 210008

β-內(nèi)酰胺類抗生素是抗生素家族中使用最廣泛的一類藥物，其使用過程中的不良反應(yīng)，尤其是過敏反應(yīng)受到了醫(yī)藥界的高度重視。多年來的研究證明，引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原是其中的高分子雜質(zhì)[1-2]，因此，對該類藥物中高分子雜質(zhì)的研究和控制，成為減少其不良反應(yīng)的重要手段。

1 β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的定義、分類及結(jié)構(gòu)特性

抗生素中的高分子雜質(zhì)一般是指藥物中相對分子質(zhì)量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。按其來源可分為外源性雜質(zhì)、內(nèi)源性雜質(zhì)和其他來源雜質(zhì)：①蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)，或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物，一般于發(fā)酵過程中產(chǎn)生，即外源性雜質(zhì)；②內(nèi)源性雜質(zhì)又稱自身聚合類高分子雜質(zhì)：在一定條件下，β-內(nèi)酰胺可以開環(huán)產(chǎn)生自身的聚合反應(yīng)[3]；③其他來源的雜質(zhì)：有部分雜質(zhì)，并非藥物分子間自身聚合產(chǎn)生，而是合成或使用過程中產(chǎn)生的高分子副產(chǎn)物或者高分子降解產(chǎn)物，如頭孢唑肟鈉樣品中可能存在的雜質(zhì)（圖1）為頭孢唑肟酸合成時(shí)的中間體與頭孢唑肟反應(yīng)的副產(chǎn)物[4]。

抗生素藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣和不穩(wěn)定性，使得其高分子雜質(zhì)結(jié)構(gòu)亦復(fù)雜多樣。例如阿莫西林樣品中的二聚體雜質(zhì)，包括開環(huán)阿莫西林二聚體和閉環(huán)阿莫西林二聚體（圖2）；不同pH的溶液中可能產(chǎn)生不同方式的聚合[5]；藥物本身同分異構(gòu)體的存在使得聚合反應(yīng)多樣，可發(fā)生同聚或異聚反應(yīng)[6]；溶液放置過程中也可發(fā)生不同程度的聚合或降解反應(yīng)[7]。

圖1 頭孢唑肟鈉樣品中的雜質(zhì)[4]

圖2 阿莫西林的二聚體結(jié)構(gòu)

2 過敏反應(yīng)與抗原決定簇的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2.1 過敏反應(yīng)

文獻(xiàn)報(bào)道的β-內(nèi)酰胺類抗生素引發(fā)的過敏反應(yīng)多數(shù)為速發(fā)型過敏反應(yīng)，也有少數(shù)遲發(fā)型過敏反應(yīng)的報(bào)告[8]。人體內(nèi)與過敏反應(yīng)相關(guān)的特異性抗體為LgE抗體[9]。近年來，喬海靈等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞在青霉素類抗生素誘發(fā)的速發(fā)型、遲發(fā)型過敏反應(yīng)中有重要作用。青霉素類抗生素特異性抗體由B細(xì)胞產(chǎn)生，該過程受不同的T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)和控制。細(xì)胞因子如IL-4、IL-10、IFN-Y等在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.2 抗原決定簇結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與交叉過敏

青霉素抗原決定簇,包括主要和次要抗原決定簇、側(cè)鏈抗原決定簇，分別位于青霉素內(nèi)酰胺環(huán)、噻唑環(huán)及青霉素6位側(cè)鏈；頭孢菌素抗原決定簇結(jié)構(gòu)主要和7位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。頭孢菌素7位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和青霉素6位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)越相似，越易引發(fā)交叉過敏反應(yīng)，若兩者側(cè)鏈結(jié)構(gòu)完全不同，則可能不發(fā)生交叉過敏反應(yīng)[14]。

3 影響高分子雜質(zhì)產(chǎn)生的因素

3.1 生產(chǎn)工藝

高分子雜質(zhì)的種類和數(shù)量與藥物的生產(chǎn)工藝有關(guān)。研究結(jié)果顯示，青霉素的結(jié)晶工藝條件是去除其致敏性高分子雜質(zhì)的關(guān)鍵[15]。

3.2 貯存和放置條件

固體條件下，水份含量是控制頭孢菌素聚合反應(yīng)速度的關(guān)鍵因素。當(dāng)貯存溫度較低時(shí)，含水量差異對高分子雜質(zhì)的含量影響不大，但高水份樣本在貯存溫度上升時(shí),高分子雜質(zhì)的含量迅速增加，而光照對高分子雜質(zhì)的含量影響較小[16]。

溶液狀態(tài)下，高分子雜質(zhì)的聚合反應(yīng)速度與放置的溫度及酸堿度有關(guān)，聚合速度隨放置時(shí)間延長增快，隨溫度升高增快[17]。圖3為頭孢唑肟鈉水溶液中的高分子雜質(zhì)與溫度的關(guān)系。

圖3 頭孢唑肟鈉水溶液中的高分子雜質(zhì)隨時(shí)間和溫度的變化曲線

4 β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的分析方法

4.1 現(xiàn)有分析方法

主要有：凝膠色譜法、反相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、離子交換色譜法、大孔樹脂法。凝膠色譜法（分子排阻色譜法）是目前測定β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)最常用的方法，針對本類抗生素中各種高分子雜質(zhì)具有相似的生物學(xué)特性（如過敏性）這一特點(diǎn)，在質(zhì)量控制中只需要控制其總量[18]。Sephadex G10凝膠是最易控制高分子雜質(zhì)總量的通用型填料。

4.2 高效凝膠色譜、高效液相色譜等分析技術(shù)的聯(lián)用

近年來，各種新型高效凝膠色譜柱應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的分離測定中，較之Sephadex G10凝膠，高效凝膠色譜具有靈敏度高、分離度好、分析時(shí)間短的特點(diǎn)，因此其多應(yīng)用于分析難以用Sephadex G10凝膠測定的品種，例如碳烯類抗生素、含酶抑制劑的雙組分抗生素及水溶性較差的抗生素等。鐘雅妮等[19]采用TSK G2500 PWXL色譜柱測定了替卡西林鈉克拉維酸鉀中的高分子雜質(zhì)；趙曉冬等[20]采用Superdex peptide 10/300GL凝膠色譜柱測定了注射用頭孢呋辛鈉舒巴坦鈉中的高分子雜質(zhì)；朱美容等[21]采用TSK G2500PWXL凝膠色譜法測定了頭孢地尼中的高分子雜質(zhì)。用于分離β-內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)的常用凝膠色譜柱及性能比較見表1。

將高效凝膠色譜與不同類型的檢測器相連，可以進(jìn)一步研究分析此類雜質(zhì)。如：與DAD檢測器相連，可監(jiān)測分離得到的雜質(zhì)的光吸收行為；與柱切換裝置相連，可將凝膠色譜分離得到的雜質(zhì)逐一切換到HPLC-C18系統(tǒng)中，進(jìn)一步分離和純化雜質(zhì)[22]；將凝膠色譜系統(tǒng)或C18色譜系統(tǒng)與MS聯(lián)用，可以測定雜質(zhì)的相對分子質(zhì)量，初步推定雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。

5 國際上對β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)控制的現(xiàn)狀

5.1 國外藥典對β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的檢測情況

《美國藥典》（USP）23版曾對頭孢他啶中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行檢測，由于β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)非常不穩(wěn)定，制備和標(biāo)化雜質(zhì)對照品非常困難，故難以供應(yīng)雜質(zhì)對照品而從藥典中取消；《英國藥典》（BP2011）在各論中對阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟鈉等品種的高分子雜質(zhì)進(jìn)行控制，采用RPHPLC法，用相對保留時(shí)間定位、主成分自身對照法測定二聚體和三聚體的含量（見表2）。

表1 用于分離β-內(nèi)酰胺抗生素高分子的常用凝膠色譜柱及性能比較

表2 BP2011中收錄控制高分子雜質(zhì)的β-內(nèi)酰胺類抗生素品種（雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式略）

5.2 《中國藥典》中β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)檢測方法的沿革

我國從20世紀(jì)70年代起就開始對β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究。胡昌勤等[25-26]建立了根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的分子排阻色譜法，根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素在水溶液中具有締合現(xiàn)象的特點(diǎn)，測定水系統(tǒng)中對照品締合峰的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品中的雜質(zhì)量。這一方法解決了RP-HPLC法分離模式中難以定位高分子雜質(zhì)的難題，為β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)控制的常規(guī)化提供了可能。

《中國藥典》從2000年版開始對頭孢他啶等4個(gè)品種及8個(gè)相關(guān)制劑的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制；2005年版增加至7個(gè)品種13個(gè)制劑標(biāo)準(zhǔn)的高分子雜質(zhì)控制；2010年版增加至22個(gè)品種43個(gè)制劑標(biāo)準(zhǔn)的控制。

6 當(dāng)前β-內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)檢測方法中存在的問題

6.1 葡聚糖凝膠Sephadex G10的局限性

柱效低、分離效果差；易受藥物的開環(huán)物等小分子、輔料以及酶抑制劑的干擾；色譜柱填料親水性，不能使用有機(jī)溶劑作為流動相，對藥物水溶性要求高等。

6.2 β-內(nèi)酰胺抗生素在凝膠介質(zhì)中受多種作用影響

β-內(nèi)酰胺抗生素在凝膠介質(zhì)中受分子排阻、吸附作用的共同影響，不能簡單地以保留體積判定β-內(nèi)酰胺抗生素及其雜質(zhì)的相對分子質(zhì)量。蔡珊英等[27]為建立和優(yōu)化β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的分離分析方法，通過研究β-內(nèi)酰胺抗生素與Superdex peptide凝膠介質(zhì)的相互作用，考察了8種β-內(nèi)酰胺抗生素在Superdex peptide凝膠介質(zhì)中不同色譜條件下的色譜行為。

6.3 HPLC-C18色譜法測定聚合物類雜質(zhì)的難度

β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，其聚合反應(yīng)的多變多樣性也給對高分子雜質(zhì)的探索研究帶來了難度。HPLC-C18色譜系統(tǒng)，是一種高效的專屬性強(qiáng)的分離系統(tǒng)。由于β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)對照品的制備和標(biāo)準(zhǔn)化都非常困難，《英國藥典》（BP）雖采用相對保留時(shí)間定位高分子雜質(zhì)峰的方法，但也需要先對高分子雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。實(shí)踐證明，HPLC-C18方法的開發(fā)難度較大，主要問題除了制備雜質(zhì)對照品困難外，還與高分子雜質(zhì)復(fù)雜多樣，樣品中雜質(zhì)量較低，在C18色譜柱上峰保留較強(qiáng)，較難洗脫，難以定位和鑒定色譜流出峰中哪些雜質(zhì)是高分子雜質(zhì)等有關(guān)。

7 抗生素高分子雜質(zhì)深入研究的方向

7.1 分析的分離機(jī)制和驗(yàn)證機(jī)制的關(guān)聯(lián)

β-內(nèi)酰胺抗生素在凝膠色譜中各組分的洗脫順序不一定完全按照相對分子質(zhì)量大小排列，因此，隨著高效凝膠色譜的廣泛應(yīng)用，需要對凝膠色譜分離得到的高分子雜質(zhì)峰的專屬性予以重視和驗(yàn)證。王成剛等[28]建立了高效分子排阻色譜法分析注射用頭孢噻吩鈉中的高分子雜質(zhì)，并采用LC-MS的方法對分離的雜質(zhì)峰進(jìn)行了測定，得到響應(yīng)值最大高分子雜質(zhì)的質(zhì)譜圖，推測其為頭孢羥氨芐的二聚體。

7.2 藥理活性與致敏量的探索

國內(nèi)經(jīng)過大量病例的臨床觀察和試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青霉素中高分子雜質(zhì)含量與過敏反應(yīng)率相關(guān)，雜質(zhì)量高，過敏反應(yīng)率高；金少鴻等首次明確提出在青霉素生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制高分子雜質(zhì)的含量[29]，對于口服青霉素高分子雜質(zhì)，原料藥中應(yīng)＜0.1%，制劑中應(yīng)＜0.2%。良好的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在于制訂安全、有效、合理的質(zhì)量控制限度，因此對高分子雜質(zhì)的藥理活性和致敏量的探索仍是非常重要的研究課題。

7.3 聚合反應(yīng)機(jī)制的深度探索

降低雜質(zhì)以降低使用抗生素副作用的危害，減少交叉過敏是提高國內(nèi)抗生素產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)品競爭力的基礎(chǔ)。需要對各類抗生素的聚合反應(yīng)的發(fā)生條件及影響因素作進(jìn)一步的研究。

7.4 交叉過敏的深入探索

據(jù)報(bào)道，青霉素類抗生素與頭孢菌素類抗生素間的交叉過敏反應(yīng)率高達(dá)19.82%[12]，頭孢抗體對藥物分子的識別具有較高的結(jié)構(gòu)特異性，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)在交叉過敏反應(yīng)中起著不容忽視的作用。對相同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的青霉素和頭孢菌素的過敏反應(yīng)的深入研究，可以為抗生素藥物聯(lián)用提供重要信息，有巨大的現(xiàn)實(shí)意義。

7.5 多方位研究和重視獸用抗生素質(zhì)量

有報(bào)道指出，β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)亦能引發(fā)牲畜的過敏反應(yīng)[30-31]，因此在研究藥物療效的同時(shí)，高分子雜質(zhì)的藥理毒理變化及其在產(chǎn)品中的殘留可作為新的研究方向。

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