分散液液微萃取-HPLC法測定藿香正氣口服液中厚樸酚與和厚樸酚含量

于秀培，馮 芳，滕寶褀，陳玉宇

中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009

藿香正氣口服液是藿香正氣水（酊劑）的水溶性制劑，由蒼術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油等10味中藥組成，具有解表化濕、理氣和中之效，主治外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯諸癥。《中國藥典》（2010年版）[1]以厚樸酚與和厚樸酚的含量作為藿香正氣口服液的質(zhì)量控制指標(biāo)；以氯仿為溶劑，液液萃取后，HPLC法測定含量。該方法實(shí)際應(yīng)用中存在操作過程繁瑣、耗時(shí)；萃取時(shí)易乳化；取樣量大；萃取劑氯仿系二類溶劑、用量較大、易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。由于分散液液微萃取技術(shù)（DLLME）具有操作簡單、樣品用量少、有機(jī)溶劑用量少、環(huán)保等特點(diǎn)，近年來得到廣泛應(yīng)用[2-3]。本文對離子液體（[C6MIM][PF6]）用量、分散劑用量、樣品溶液pH和氯化鈉加入量等影響DLLME的因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了離子液體[C6MIM][PF6]為萃取劑，基于DLLME-HPLC技術(shù)的藿香正氣口服液中厚樸酚與和厚樸酚的含量測定方法。

1 儀器和試藥

LC-10AD高效液相色譜儀、Prominence SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A真空脫氣機(jī)、CTO-10AS柱溫箱、CBM-20A、LCSolutions工作站 （日本島津公司）；TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ABS135-S電子天平 （梅特勒-托利多公司）；pHS-25型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C6MIM][PF6]）（中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所）；藿香正氣口服液 （規(guī)格10 mL，同一生產(chǎn)廠家，批號10020105、11030011、11030260、11050107）;厚樸酚與和厚樸酚（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；丙酮為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為色譜純（江蘇漢邦）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Lichrospher C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相:甲醇-水 （83∶17）;檢測波長:294 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取厚樸酚與和厚樸酚對照品適量，分別用甲醇溶解并稀釋、搖勻得濃度為1 mg·min-1的厚樸酚與和厚樸酚儲(chǔ)備液。以甲醇為溶劑，依次稀釋配制成6份不同濃度的混合對照品溶液，其濃度分別為：厚樸酚 800、600、400、200、80、40 μg·mL-1， 和厚樸酚 600、450、300、150、60、30 μg·mL-1；精密量取厚樸酚儲(chǔ)備液與和厚樸酚儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成每毫升含厚樸酚與和厚樸酚均為230 μg的混合對照品溶液，-20℃冰箱保存。

2.2.2供試品溶液精密吸取50 μL藿香正氣口服液，置于玻璃離心管中，加入 5.0 mL水（pH4），混勻，快速注入[C6MIM][PF6]-丙酮（80 mg∶0.5 mL）混合液，渦旋混勻，4000 r·min-1離心，棄去上層溶液，下層用 100 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，16000 r·min-1離心，HPLC法分析。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取6份不同濃度的混合對照品溶液50 μL，按“2.2.1”操作，記錄色譜圖，測定峰面積。以樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

Y=1.0×106X-1.119×104，r=0.9999（厚樸酚）；

Y=1.0×106X-6.389×103，r=0.9998（和厚樸酚）。

結(jié)果表明，厚樸酚在 0.4～8 μg·mL-1、和厚樸酚在 0.3～6 μg·mL-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4 檢測限及定量限

按“2.2.1”操作，制備系列低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣，按S/N＝3確定厚樸酚與和厚樸酚的檢測限分別為 10 ng·mL-1和 8 ng·mL-1； 按 S/N=10 確定厚樸酚與和厚樸酚的定量限為30 ng·mL-1和25 ng·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取每毫升含厚樸酚40 μg與和厚樸酚30 μg的混合對照品溶液，連續(xù)測定6次，結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD均為0.1%，進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)符合要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液6份，按“2.2.2”操作，HPLC法測定，結(jié)果表明，制劑中厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.9%和1.7%。表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液 （厚樸酚與和厚樸酚含量分別是 0.2364 和 0.2255mg·mL-1）50μL 6 份，分別精密加入每毫升含厚樸酚與和厚樸酚均為230μg的混合對照品溶液50μL，按“2.2.2”操作制備供試品溶液。測得厚樸酚平均回收率（n=6）為102.1%，RSD為2.2%；和厚樸酚平均回收率（n=6）為96.2%，RSD為1.4%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液， 分別于 0、0.5、1、3、4 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD分別為2.9%和1.5%，表明供試品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

精密吸取樣品溶液，按“2.2.2”操作，測定峰面積，分別計(jì)算厚樸酚與和厚樸酚的含量，結(jié)果見表1，所建方法的色譜圖見圖1。

表1 藿香正氣口服液中厚樸酚與和厚樸酚含量（mg·mL-1,n=3)

圖1 厚樸酚（2）與和厚樸酚（1）的高效液相色譜圖

3 討 論

3.1 離子液體-分散液液微萃取條件的優(yōu)化

3.1.1 離子液體的選擇Zhang Hong-Fei等[2]報(bào)道了[C6MIM][PF6]用于大黃藥材中蒽醌類化合物的提取，厚樸酚與和厚樸酚的結(jié)構(gòu)和蒽醌類化合物均含多個(gè)苯環(huán)（結(jié)構(gòu)見圖2），因此在預(yù)試驗(yàn)中首選此種離子液體。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，此種離子液體作萃取劑時(shí)厚樸酚與和厚樸酚的提取回收率大于80%（R=Csed·Vsed/（C0·Vaq）·100%；Csed和 C0分別是待測物在復(fù)溶液和樣品溶液中的濃度，Vsed和Vaq分別是復(fù)溶液及樣品溶液的體積），因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇[C6MIM][PF6]作萃取劑。

圖 2 厚樸酚（A）、和厚樸酚（B）和[C6MIM][PF6]（C）的結(jié)構(gòu)式

3.1.2 分散劑的選擇首先考察了不加分散劑，[C6MIM][PF6]用量為 80 mg，水浴 30℃、50℃、70℃各30 min 和超聲5 min四種條件的提取回收率，結(jié)果表明，R＜50%。為了提高提取回收率，參考文獻(xiàn)[2-3]加入既溶于離子液體相，又溶于水相的分散劑。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈作為分散劑時(shí)，注入乙腈與離子液體的混合溶液后，樣品溶液很難形成乳濁液，丙酮的提取回收率比甲醇高，故選擇丙酮為分散劑。

3.1.3 分散劑用量試驗(yàn)中考察了丙酮體積0.30、0.50、0.60、0.80、1.0 mL 對提取回收率的影響。 結(jié)果表明，隨著丙酮體積的增大，提取回收率先增大后減小。適量的丙酮可以使離子液體在水相中分散成細(xì)小的液滴，使溶液形成良好的“水／丙酮／離子液體的乳濁液體系”，增大離子液體與待測物的接觸面積；丙酮的體積較大時(shí)，待測物在溶液中溶解度增大，不易被離子液體萃取，提取回收率降低。所以在試驗(yàn)中丙酮的加入體積為0.5 mL。

3.1.4 離子液體用量離子液體用量越大，離心后下層越多，富集因子（EF=Csed/C0）越小，應(yīng)控制其加入量（由于其黏度大，在試驗(yàn)中采用稱量的方式定量加入）。 試驗(yàn)中考察了 60、70、80、90、100 mg 的用量，結(jié)果顯示，隨著離子液體用量的增加，提取回收率逐漸增大，加入分散劑與離子液體的混合液后渾濁程度越大，但是富集因子減小。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)的試驗(yàn)中選擇離子液體為80 mg。

3.1.5 pH溶液的pH決定酸性或堿性物質(zhì)的存在狀態(tài)，對提取效率有很大影響。文獻(xiàn)[4]報(bào)道厚樸酚pKa17.10，pKa210.58； 和 厚 樸 酚 pKa19.64，pKa210.71。本試驗(yàn)考察了pH 3～7范圍內(nèi)提取效率的變化，結(jié)果顯示pH為4時(shí)提取回收率最高。

3.1.6 提取時(shí)間在本試驗(yàn)中提取時(shí)間是指注入分散劑和離子液體的混合液后到開始離心這段時(shí)間。為了考察提取時(shí)間對提取回收率的影響，考察了靜置 1、5、10、20、30 min。 結(jié)果顯示，提取時(shí)間對回收率沒有顯著影響，表明當(dāng)分散劑和離子液體的混合液注入待測溶液后，因形成高度分散的乳濁液，離子液體與樣品溶液接觸的表面積很大，待測化合物迅速轉(zhuǎn)移到萃取劑中。

3.1.7 離心時(shí)間本試驗(yàn)考察了 2、5、10、15、20 min等不同的離心時(shí)間對提取回收率的影響。結(jié)果表明，隨著離心時(shí)間的增加，提取效率出現(xiàn)先增大、10 min后卻減小的現(xiàn)象，可能是由于離心時(shí)間較長時(shí)，混合相的溫度升高，離子液體在水中溶解度增加，造成離心后離子液體的體積減少，故在后續(xù)的試驗(yàn)過程中確定為10 min。

3.1.8 氯化鈉加入量對于酚類等極性化合物的提取，傳統(tǒng)的液液萃取過程中常加入一定量的鹽，以提高待測物在有機(jī)溶劑中的分配比。本試驗(yàn)曾考察了氯化鈉加入量為0～4%時(shí)對提取回收率的影響，結(jié)果顯示，隨著氯化鈉加入量的增加，離子液體層體積減小，提取回收率下降，原因可能是[C6MIM][PF6]轉(zhuǎn)化為可溶于水的[C6MIM]CL，故不宜加入。

3.2 流動(dòng)相組成的確定

2010年版《中國藥典》[1]以甲醇-異丙醇-水（36∶21∶36）為流動(dòng)相，測定藿香正氣口服液中厚樸酚與和厚樸酚的含量。經(jīng)試驗(yàn)，本文采用甲醇-水（83∶17）作為流動(dòng)相，顯著降低了色譜系統(tǒng)壓力，縮短了分析時(shí)間，同時(shí)兩個(gè)待測化合物與共存成分實(shí)現(xiàn)了基線分離。

3.3 本方法特點(diǎn)

《中國藥典》方法的萃取過程中極易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象以及氯仿蒸干過程易造成試驗(yàn)誤差。從樣品測定結(jié)果看，所建方法提取效率更高，厚樸酚與和厚樸酚含量均高于《中國藥典》方法。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1231.

[2] Zhang HF,Shi YP.Temperature-assisted ionic liquid dispersive liquid–liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography for the determination of anthraquinones in Radix et Rhizoma Rhei samples[J].Talanta,2010,82(3):1010-6.

[3] 張彥杰，白小紅，李利華，等.分散液液微萃取快速測定中藥中4種呋喃香豆素化合物[J].分析化學(xué)，2009，37（12）：1805-9.

[4] 保志娟，戴 琳，苗兆濤，等.紫外分光光度法測定厚樸酚及和厚樸酚的解離常數(shù)[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，26（1）：66-9.