化學發光法和放射免疫法檢測胰島素

魯 彥 岳建云 苑 芳 黃 瑋 王成龍 杜 薇

酶聯免疫吸附試驗(EIA)、放射免疫(RIA)和化學發光(CLIA)技術是當代蛋白質和多肽定量3種重要的檢測技術。化學發光技術產生于1977年，是由Halman在放射免疫技術的原理基礎之上，將化學發光和免疫反應結合建立起來的方法［1］。ADVIA Centaur發光儀(以下簡稱CP)是西門子公司收購前德林公司后開發出來的產品。筆者所在科室2010年底裝備了西門子ADVIA Centaur化學發光儀。盡管比較化學發光儀和放射免疫檢測激素的研究已甚多，但有關CP發光儀檢測激素的研究目前不多。因此本研究通過RIA和CP同時檢測了52份胰島素標本，對西門子化學發光儀CP檢測結果進行分析和評價。

材料與方法

1.研究對象:筆者醫院2011年6～7月胰島素標本52份，其中男性25人，女性27人，患者平均年齡59.3歲。

2.試劑和設備:RIA使用的設備為中佳合肥科技有限公司生產的γ計數儀，試劑由山東濰坊三維生物工程集團有限公司提供，批號20110720。CLIA檢測設備為西門子公司生產的CP化學發光儀，試劑使用西門子公司原裝胰島素試劑，試劑批號:066077。

3.研究方法:所有患者用真空干燥管靜脈采血，室溫下3800r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存備用。RIA和CLIA均由操作熟練的專門技術人員操作。測定前先做質控品，每次測試均帶陽性對照、陰性對照和標準品，以保證檢測結果的可靠性。

放免法檢測基本原理為競爭性放射免疫分析法。血清中的胰島素和試劑中125I-胰島素抗原同時與試劑中的胰島素抗體結合，形成抗原抗體復合物。加入免疫分離劑，將免疫復合物沉淀出來，離心后，抽棄上清，用γ計數儀測量沉淀的放射性計數(cpm)。血清中胰島素含量越高，試管中cpm值越低，二者呈現反比關系。化學發光法原理為直接化學發光技術。即第一抗體為吖啶酯標記的單克隆鼠抗胰島素抗體，二抗為固相試劑內共價偶合到順磁性微粒上的單克隆鼠抗胰島素抗體。血清中的胰島素與吖啶酯標記的一抗結合，然后加入固相二抗。血清內胰島素再與固相內二抗結合，分離未結合的一抗，啟動化學發光反應，血清中的胰島素的含量與系統檢測的相對光單位(RLUs)數量呈現一定的直線關系。

4.統計學方法:經過正態性檢驗和方差齊性檢驗，本組胰島素實驗結果數據不符合正態分布，故使用中位數表示兩種方法檢測結果。Wilcoxon配對符號的秩和檢驗比較兩種方法檢測結果的差異，Spearman統計表示兩種方法的相關性。

結 果

1.RIA和CLIA檢測結果比較:為了比較兩種檢測方法之間有無差異，我們同時用RIA和CLIA法測試了52個標本內胰島素含量，通過Wilcoxon配對符號的秩和檢驗比較二者之間有無顯著性差異。RIA和CLIA檢測胰島素的中位數分別為33.48和27.50(Z=-3.23，P＜0.01)，認為兩種方法檢測結果之間有統計學差異。

2.兩種方法之間的相關性研究:為了比較CLIA和RIA檢測胰島素結果之間有無相關性，我們用Spearman檢測兩種方法的相關性，用散點圖表示結果(圖1)。Spearman相關系數為0.845，認為兩種方法檢測結果具有高度相關性(P＜0.01)。散點圖相關系數為0.92，與Spearman結果一致，認為兩種方法之間高度相關(P＜0.05)。

圖1 RIA和CLIA檢測胰島素結果散點圖(R2=0.92，P ＜0.01)

討 論

我們的實驗結果表明，應用RIA和CLIA檢測同一份標本，兩個結果之間有顯著性差異，但兩種方法檢測結果之間高度相關。

EIA、RIA和CLIA作為當代蛋白質定量檢測的3大技術，具有各自優點和缺點。EIA具有試劑成本低，不需要特殊設備(如果要定量檢測需要酶標儀，價格在5萬元以內不等)，廢液不含放射性核素，對工作人員和環境污染比較小等優點，在大型醫院和大部分基層與醫院均可使用，應用范圍廣泛。EIA缺點是檢測靈敏度比較低(10-9g/L)，檢測微量蛋白質或微量激素結果準確性差［2，3］。近年來發展出來的全自酶聯分析儀是EIA方法實現了自動化，但全自動酶聯分析儀本身價格昂貴(100萬～200萬之間)，目前在廣大醫院難以普及。RIA方法的優點是試劑成本低，檢測結果精確性比較高(10-15～ 10-12g/L)［4～6］，但需要γ計數儀(大約10萬～20萬元不等)。RIA缺點是:①125I等同位素對工作人員和環境產生的放射性污染;②125I半衰期比較短(60天)，試劑穩定性比較差［7］。如果試劑未用完，第2次檢測必須重新做曲線，結果準確性也會大大降低。CLIA具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便，可實現全自動化的優點［8］。應用范圍廣泛，既可檢測抗原、半抗原和抗體，亦可檢測核酸。CLIA無輻射、標志物有效期長，因此試劑穩定性好［9，10］。缺點是試劑成本價高，需要特殊設備(設備價格30萬～150萬不等)。RIA和CLIA均需特殊設備，限制了兩種方法的使用，許多基層醫院均不能配備γ計數儀和化學發光儀，因此不能應用這兩種方法。

筆者所在科室2010年配備了西門子化學發光儀。西門子化學發光儀系收購前德靈技術后開發出的產品。盡管目前比較RIA和CLIA的研究很多，但將CP檢測結果和RIA結果進行比較并且評價的研究甚少。因此我們選擇52份血清，通過兩種方法進行檢測，對其結果進行評價。結果表明，CLIA和RIA檢測結果不一致，不一致的原因可能是由于:①兩種方法的標準品不一致［11］;②化學發光法使用單克隆抗體，放免法使用多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體敏感性和特異性不一致;③兩種試劑盒分別由不同的廠家生產，使用的抗體片段不完全一致。但兩種方法具有高度相關性，因此測試結果具有一定的可靠性。由于條件的限制，無論RIA、CLIA還是EIA均非測定胰島素的金標準，相互之間對比缺少標準參考條件，限制了CLIA評價的準確性。

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