高/低侵襲轉移性肺癌干細胞模型的建立

曾 芳 劉曉光 樂涵波

近20年來，中國肺癌導致的死亡超過癌癥總死因的20%，其發生率和病死率在我國男性居惡性腫瘤之首位，在女性僅次于乳腺癌居第2位［1］。雖然近年來肺癌的診治水平有了明顯進步，形成了以手術切除為主，化療、放療、各種介入治療、免疫和中醫藥治療為輔的綜合治療模式，但肺癌具有起病隱匿、潛伏期長、惡性高、進展快、侵襲性強、預后差、病死率高等特點，導致全球肺癌患者術后5年生存率僅15%［2］。其原因可能是肺癌干細胞(lung cancer stem cells，LTSCs)的存在。LTSCs成瘤能力極強，分化程度極低，是肺癌組織發生、發展、侵襲、轉移、耐藥、復發的基礎和源頭［3］。有學者提出LTSCs既是肺癌轉移的“種子”，也是腫瘤侵襲和轉移的主要承擔者［4］。因此，人們推斷肺癌是肺癌干細胞增殖和分化形成的腫瘤器官，肺癌干細胞的殘存是肺癌復發的根源［5，6］。

目前開展LTSCs研究的首要問題就是分離鑒定。普遍的方法是采用Hoechst 33342染色干細胞，經流式細胞儀分選肺癌細胞系側群(side population，SP)細胞的SP細胞分選技術，或者利用LTSCs特異性細胞表面分子標志CD133+/CD90+/EpCAM+等經磁珠或流式細胞儀分選LTSCs。然而這兩種分選方法均存在自身局限性。SP法主要因為Hoechst染料的毒性，可能造成主群細胞自我更新能力及致瘤性低的假象。其次，分選后的SP細胞不能完全體現LTSCs的特性和活性，甚至不能在體外繼續生長或體內成瘤。而采用細胞表面標志分離出來的LTSCs均一性不好，還可以細分成不同亞群，有些亞群的細胞根本不能成瘤，表明采用該方法篩選出來的不完全是LTSCs，或者是LTSCs存在著干性差別［7］。基于此，課題組設想建立一種高/低侵襲性肺癌干細胞(high/low invasion lung tumor stem cells，H/L-ILTSCs)模型，可以與目前的分選方法互為完善和補充，建立一種更加可靠的LTSCs。這對于LTSCs的機制研究及病理治療均有重要的意義，為研究肺癌的侵襲和轉移機制提供了新的思路。

材料與方法

1材料:(1)主要試劑:人小細胞肺癌細胞系NCI-H446購上海中科院典型培養物保藏中心。DMEM/F12(1∶1)培養基購自Gibco公司。RPMI-1640培養基購自天津潤泰科技發展有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Hy-Clone公司。Transwell小室購自coring公司。Matrigel膠購自BD公司。胰蛋白酶、MTT購自碧云天生物科技有限公司。NOD-SCID免疫缺陷裸鼠購自上海中科院實驗動物中心。CD133、CD44磁珠及流式抗體分別購自Miltenyi及BD公司。(2)細胞培養:將NCI-H446細胞用RPMI-1640培養液培養，內含10%胎牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100mg/L，置37℃，5%CO2環境下培養備用。

2.方法:(1)高/低遷移性的NCI-H446細胞的分離:取對數生長期NCI-H446細胞及未涂Matrigel膠的transwell小室，參照Tie等［8］文獻操作。直接將NCI-H446細胞懸液加到上室，常規培養24h后，分別取出侵襲小室上、下室細胞。將穿過膜(下室)的細胞擴增培養后再次通過未涂Matrigel膠的transwell小室，獲取遷移能力高的下室細胞;將未穿過膜(上室)的細胞擴增培養后再次通過未涂Matrigel膠的transwell小室，獲取遷移能力低的上室細胞。如此反復10次后，分離得到高/低遷移能力的NCI-H446細胞。(2)高/低侵襲轉移性的NCI-H446細胞的分離:取上述分離得到的對數生長期高/低遷移能力的NCI-H446細胞及涂有Matrigel膠的transwell小室。直接將高遷移能力的NCI-H446細胞懸液加到上室，常規培養24h后，取出侵襲小室下室細胞，獲得高侵襲轉移能力的NCI-H446細胞;將低遷移能力的NCI-H446細胞懸液加到上室，常規培養24h后，取出侵襲小室上室細胞，獲得低侵襲轉移能力的NCI-H446細胞。(3)H/LILTSCs、H/L-ILTSCs的分離:CD133、CD44為肺癌干細胞表面標志采用磁珠分選法。高侵襲轉移性NCI-H446肺癌細胞篩選CD133+/CD44+細胞為高侵襲轉移能力NCI-H446肺癌干細胞;低侵襲轉移能力NCI-H446肺癌細胞篩選CD133+/CD44+細胞為低侵襲轉移能力NCI-H446肺癌干細胞。參照Miltenyi公司試劑盒說明書，將高/低侵襲性NCIH446肺癌細胞計數，加入CD133、CD44等磁珠混勻，冰上放置30min后，加CD133/2(293C3)-PE、CD44-FITC染色孵育5min，進行磁珠分選后流式細胞儀上檢測純度。(4)H/LILTSCs的鑒定及侵襲轉移特性分析:①MTT比色法檢測HILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞的生長增殖能力:收集對數生長期細胞，每孔加入200μl，鋪板使待測細胞調密度103～104/孔。5%CO2，37℃ 孵育，過夜后在 3、6、12、18、24、30、36、42、48h等不同時間點，每個時間點設5個復孔。每孔加20μlMTT溶液(5mg/ml)，繼續培養4h，小心棄去孔內培養液。加入150μl二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度(A)值，以時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線;②Transwell腫瘤侵襲實驗分析H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞的侵襲轉移能力:取分離得到的高/低侵襲轉移能力的NCI-H446細胞及NCI-H446細胞，在侵襲小室上室加對數生長期細胞1×104個/毫升，用含0.5%胎牛血清DMEM/F12培養基培養。下室加入含10%胎牛血清DMEM/F 12培養基。每組細胞重復3個樣本，常規培養48h后取出小室，擦去微孔膜上層細胞后結晶紫染色，顯微鏡下觀察膜下層細胞并計數。采用結晶紫染色，計數5個視野下的平均穿膜數(%);③采用免疫缺陷動物成瘤能力對H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞進行鑒定:取對數生長期細胞及4～8周NOD-SCID免疫缺陷小鼠，按1∶1比例與Matrigel混合。皮下注射100μl。每周1次觀察腫瘤生長狀況，至腫瘤直徑≥1cm或者觀察期達4周時將小鼠斷頸處死，觀察各組小鼠有無腫瘤形成，摘取皮下腫瘤檢查瘤體生長形態、直徑、質地、活動度。

3.統計學方法:應用SPSS 13.0軟件處理數據，實驗結果用均數±標準差±s)表示，實驗重復至少3次。兩組資料均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞的磁珠分選的純度:H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCI-H446細胞CDl33+/CD44+細胞的比例分別為(94.85±2.62)%、(94.03±1.53)%、(9.48±2.14)%。其中H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞 CDl33+/CD44+比例均高于培養的NCI-H446細胞，差異有統計學意義(P＜0.01)。而 H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞 CDl33+/CD44+比例沒有差別(P＞0.05)。故 H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞的磁珠分選的純度較高，達到了90%以上，見圖1。

2.采用MTT法檢測H-ILTSCs、L-ILTSCs的生長增殖能力:連續培養2天的吸光度值繪制生長曲線。MTT檢測結果顯示，隨著時間的延長 HILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞的吸光度值是逐漸增高的。在相同的時間內，H-ILTSCs的吸光度值較L-ILTSCs及NCI-H446細胞明顯增高，顯示更強的體外增殖能力，差異具有統計學意義(P＜0.01)。而L-ILTSCs、NCI-H446細胞增殖速度相當，無明顯差異(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs的細胞增殖能力很強，遠高于L-ILTSCs和NCI-H446細胞，見圖2。

3.采用transwell腫瘤侵襲實驗鑒定H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞的侵襲轉移能力:取相同H-ILTSCs、L-ILTSCs細及NCI-H446細胞密度通過Transwell小室侵襲實驗發現，H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCIH446細胞鏡下5個視野細胞平均穿膜數分別是402±40、42 ±3、59±4。H-ILTSCs的穿膜數是NCI-H446細胞的近7倍，是L-ILTSCs的近10倍，差異具有統計學意義(P＜0.01)。而L-ILTSCs與NCI-H446細胞的平均穿膜數差異無統計學意義(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs的細胞侵襲轉移能力最強，遠高于L-ILTSCs和NCI-H446細胞，見圖3。

圖2 H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCI-H446細胞的生長增殖曲線

圖3 Transwell侵襲實驗比較H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞的侵襲轉移能力(×400)

4.H-ILTSCs、L-ILTSCs細胞免疫缺陷動物成瘤能力鑒定:接種 H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCIH446細胞裸鼠在6周后可觀察到形成明顯的移植瘤，成瘤率100%。同樣以5×105細胞數量接種的情況下，H-ILTSCs形成的移植瘤體積為2380.6±685.86mm，L-ILTSCs形成的移植瘤體積為2380.60±685.86mm，而NCI-H446細胞形成的移植瘤體積為354.40±67.62mm。因此，H-ILTSCs細胞形成的移植瘤體積大于L-ILTSCs及NCI-H446細胞的移植瘤體積(P＜0.01)，L-ILTSCs注射裸鼠形成的移植瘤體積與NCI-H446細胞無明顯差別(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs相比L-ILTSCs細胞具有更強的干性特征，其裸鼠成瘤能力遠高于L-ILTSCs及NCIH446細胞，見圖4。

討 論

LTSCs是肺癌研究領域的最新前沿，LTSCs的研究不但有助于了解肺癌的發生發展、復發轉移，同時可能對肺癌的臨床診斷及治療帶來重大突破。它為腫瘤研究開辟了一個新的視野，這將徹底地顛覆腫瘤的既往治療策略。然而，LTSCs從標志物篩選、細胞分選到培養技術，從基本生物學特性、啟動腫瘤發生、侵襲轉移機制到檢測和治療意義，都還存在諸多科學問題亟待解決。

圖4 H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細胞免疫缺陷動物成瘤能力比較(移植5×105細胞，6周)

我們知道，腫瘤侵襲和轉移啟動中的一個關鍵過程是上皮細胞—間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT以上皮細胞極性喪失并獲得間質細胞表型和運動能力為特征，可調控腫瘤侵襲、轉移，并可能誘導TSCs的形成。一些學者認為腫瘤轉移不再是惡性腫瘤進展過程中的晚期事件，原位癌或未惡變的上皮細胞即有轉移的能力［9］。Peter［10］證實成熟的上皮細胞和轉化了的癌細胞經過EMT能夠獲得干細胞特性。Hermann等［11］進一步判斷EMT過程中關鍵細胞可能是TSCs，完成這種轉移的癌細胞實際上是轉移性 TSCs或侵襲性 TSCs。Mani［12］也認為EMT可能使乳腺癌細胞同時具有轉移和干細胞特性的通路，導致轉移的腫瘤細胞在轉移位置成長為肉眼可見的腫瘤。George等［13］采用原代培養及永生化的前列腺癌細胞系，經流式細胞儀通過CD44+等表面標志篩選前列腺癌細胞亞群，通過Matrigel腫瘤侵襲實驗和NOD/SCID免疫小鼠體內成瘤能力證實CD44+前列腺癌細胞具有侵襲性，基因芯片分析侵襲性前列腺癌細胞具有干細胞基因組特征，屬于前列腺TSCs。Hermann等［14］利用人胰腺癌細胞作為模型，用原代和永生化細胞系識別出了一小群類似于干細胞的腫瘤細胞，其表達CD133和趨化因子受體4(chemokinereceptor 4，CXCR4)，當研究人員將這些細胞注射入小鼠中時，小鼠形成腫瘤并很快發生轉移，說明CD133+和CXCR4+癌干細胞是腫瘤轉移所必需的。陳宏昌等［15］發現 CK7-/CK20+/CEA+/SCCA-表達的UP-LN1癌細胞為TSCs，同時大量陽性表達CD133、ABCC1、ABCC4、ABCG2 等常見 TSCs標志，其表達CD133+和CXCR4+的TSCs具有侵襲和轉移潛能，TSCs可被CXCR4誘導成為轉移性TSCs。

因此，本課題組基于TSCs前期研究成果，首次提出“H/L-ILTSCs”的概念，認為這可能是肺癌發生遠處轉移的基礎及源頭。以H/L-ILTSCs為重點研究對象，揭示肺癌侵襲、轉移、復發的源頭，在研究思路和研究內容上具有創新性。那么，如何建立H/LILTSCs細胞模型呢?腫瘤侵襲和轉移啟動中的一個關鍵過程是上皮細胞-間質細胞轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，EMT 是以上皮細胞極性喪失并獲得間質細胞表型和運動能力為特征，可調控腫瘤侵襲、轉移，并誘導TSCs的形成。Milena認為在腫瘤發展過程中，發生EMT改變的腫瘤細胞浸潤、轉移、成瘤能力均大為增強，并獲得了干細胞特性。由上可知，分化成熟的上皮細胞和癌細胞能夠通過EMT獲得干細胞特性，反之，TSCs能否發生EMT而獲得強大的運動能力從而決定腫瘤的侵襲和轉移，這種疑問成為我們課題思路及技術實施的關鍵點。

據報道，CD133、CD44代表原始的、未分化的標志，可作為分選 LTSCs的侯選標志。選擇 CD133、CD44細胞表面蛋白磁珠分選來識別和分離LTSCs。通過流式分析純度發現NCI-H446細胞中CD133+/CD44+的細胞比例為(9.48±2.14)%，遠低于分選出來的CD133+/CD44+細胞比例為90%以上的H/L-ILTSCs。在transwell侵襲實驗中，發現高度表達CD133+/CD44+的H-ILTSCs侵襲能力明顯高于L-ILTSCs及原肺癌細胞NCI-H446。

本實驗闡明H-ILTSCs的生長增殖，侵襲轉移及成瘤能力均高于L-ILTSCs及NCI-H446細胞。而L-ILTSCs的生長增殖，侵襲轉移及成瘤能力與NCI-H446沒有顯著差別。提示NCI-H446細胞中可以分離和富集H/L-ILTSCs。課題組建立了一種更為可靠的H/L-ILTSCs模型，且二者存在著干性差別。

腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學特性密切相關，惡性程度越高的腫瘤細胞體外生長增殖和遷徙轉移能力越強;反之，惡性程度低的腫瘤細胞的體外生長增殖和遷徙轉移能力越弱。因此，在未來的腫瘤防治研究或藥物篩選中，應該強調針對H-ILTSCs的治療作用，力求將H-ILTSCs全部清除。此外，H/L-ILTSCs的提出為下一步研究肺癌細胞轉移的相關分子機制打下基礎。

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