人骨髓間充質干細胞與血管內皮細胞的基因表達差異分析

劉丹丹 陳麗瓊 仇 容 銀國利 沈香娣

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多能成體干細胞，因具有取材方便、增殖能力強、免疫原性低和廣泛的分化潛能而成為目前細胞治療、基因治療和組織工程方面的研究熱點。不同組織來源的MSCs在血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、地塞米松、低血清或無血清培養基等多種誘導體系的作用下，可以成功地定向分化為血管內皮細胞，不同程度表達內皮細胞相關表型，甚至形成血管網絡樣結構，成為血管組織工程和缺血組織細胞移植的理想種子細胞［1～3］。但MSCs分化為內皮細胞的機制目前尚不清楚，其分化過程的調控靶標尚未確立。本實驗采用基因芯片技術對人骨髓間充質干細胞(hMSCs)和臍靜脈內皮細胞(hUVECs)進行了基因組規模的表達差異分析，結果報告如下。

材料與方法

1.材料:hMSCs和hUVECs分別從健康志愿成人骨髓、臍帶靜脈分離獲得;淋巴細胞分離液percoll、低糖DMEM培養基購自GIBCO;優等胎牛血清購自HYCLONE;UNIQ—10柱式RNA抽提試劑盒購自上海生工;基因芯片BiostarH—40S為上海博星基因公司產品。

2.方法:(1)hMSCs的分離、培養:取健康成人骨髓5～10ml，離心沉淀血細胞，疊加到percoll分離液上，離心后吸取單個核細胞層，10%FBS的L-DMEM懸起，接種于24孔培養板中。3天后換液，hMSCs貼壁生長。以后每3天換液，細胞80%融合，傳代擴大培養，收集P5～P6代細胞待用。(2)hUVECs的分離、培養:酶消化法收集hUVECs，接種于培養瓶中，加M200培養基，擴增培養傳至P3代備用。(3)hMSCs和hUVECs RNA的提取、分析:收集hMSCs和hUVECs各約(1～2)×107細胞，UNIQ-10柱式RNA抽提試劑盒分離細胞總RNA，測定所提RNA的OD260、OD280，計算RNA含量及純度。瓊脂糖凝膠電泳確認總RNA中18S、28S、5S RNA的完整性并進行熱穩定性驗證。(4)hMSCs和hUVECs RNA的芯片檢測及分析:以hMSCs、hUVECs為實驗組和對照組，分別用Cy5、Cy3熒光素標記，依次進行預雜交、探針標記、雜交、洗片、掃描與分析操作。Scan Array 4000掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 3.0軟件進行圖像處理，ImaGene 3.0軟件分析Cy5、Cy3熒光信號強度和比值。實驗重復3次。每張基因芯片BiostarH-40S含4096個點，其中包括控制系統(148個基因)和有效基因(3948個基因)。控制系統中設16個空白對照用以排除芯片掃描時的背景信號，判別不同樣品間是否存在交叉污染;16個陰性對照檢驗雜交時是否存在外源性污染;20個內參校準熒光信號強度;96個管家基因均衡Cy5、Cy3值，保證雜交結果的可靠性。(5)原位雜交檢測:將細胞固定在玻片上，用含5μg/L蛋白酶，37℃水浴消化10min。PBS洗滌后，梯度乙醇脫水，干燥。加入地高辛—RNA探針進行雜交，PBS洗滌后加入堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，孵育4h加入顯色液，室溫避光顯色，鏡下控制，終止反應。黑色顆粒為陽性結果。

結 果

1.hMSCs和hUVECs的RNA鑒定:經純化，hMSCs和hUVECs的RNA OD260/OD280比值均在2.0左右，純度較高，符合基因芯片檢測的要求。變性瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，常溫下和70℃保溫1h電泳圖譜上都可觀察到清晰的28S、18S條帶，5S條帶相對較弱，證明了所提RNA的完整性和熱穩定性。

圖1 hMSCs和hUVECs的RNA的瓊脂糖凝膠電泳譜

2.hMSCs和hUVECs的基因芯片表達差異:根據差異表達篩選條件:①Cy5、Cy3值均＞200或其一＞800;②Cy5/Cy3比值 ＜0.5或者 ＞2。在所檢測的3948條有效基因中，hMSCs和hUVECs的差異表達基因為627條，3321條基因在 hMSCs和hUVECs之間表達無明顯差異，約占有效基因的84%，表1列出了非差異表達的前19條基因。差異表達的627條基因中，hMSCs高表達基因283條，約占7.2%，表2列出了顯著高表達的前19條基因;hMSCs低表達基因共344條，約占8.7%，表3列出了顯著低表達的前19條基因。

3.原位雜交分析:為了檢驗基因芯片檢測結果的可靠性，我們采用了原位雜交方法來驗證hMSCs和hUVECs細胞中部分差異表達的基因，包括hMSCs高表達的纖維連接蛋白(FN1)基因、Ⅳ型膠原基因、表皮生長因子受體(EGFR)基因和血小板源性生長因子受體(PDGFR)基因;hMSCs低表達的Ⅷ因子基因。雜交結果與基因芯片結果一致。

表1 hMSCs和hUVECs共表達的部分基因

表2 hMSCs高表達的部分基因

表3 hMSCs低表達的部分基因

討 論

從基因芯片檢測的hMSCs和hUVECs表達的基因功能來看，主要包括以下5大類:①細胞骨架和運動蛋白基因;②細胞受體相關基因;③細胞信號和傳遞蛋白相關基因;④發育相關基因;⑤蛋白翻譯、合成相關基因。

在非差異表達基因中，hMSCs除了顯著高表達Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子1(VCAM-1)等和內皮細胞相關的細胞外基質和黏附分子家族基因外，還高表達內皮分化相關因子1(EDF1)、溶血磷脂酸受體1(LPAR 1)、DNAJB9、血管內皮生長因子受體2(KDR)等8個內皮細胞早期分化發育相關基因。

EDF1調控內皮細胞分化，在連接調控蛋白和基礎轉錄機制上起橋接分子的作用，在通用轉錄因子TATA結合蛋白和基因特異性激活因子之間起轉錄輔助激活因子的功能，控制內皮分化相關基因的轉錄。溶血磷脂酸受體1(LPAR 1)是G-蛋白偶聯的受體超家族成員，和溶血磷質酸結合后參與細胞信號傳導和內皮分化鞘磷脂G-蛋白偶聯受體介導的多種生物學功能，包括細胞增殖、遷移等。近來已有實驗證明人脂肪組織來源的MSCs在人肺腺癌細胞A549的誘導下，通過LPA-LPAR1介導的旁分泌機制在腫瘤微環境的血管生成中有重要作用［4］。DNAJB9屬于熱休克蛋白Hsp40家族成員，調節70 kDa HSP的ATP酶活性，參與內皮細胞內質網應激反應中，組織相容性白細胞抗原HLA-B35上調內皮素1和下調NO合酶的過程［5］。因此，MSCs具有內皮分化的分子基礎，為MSCs作為血管組織工程的種子細胞提供了細胞遺傳學和免疫學依據。

以內皮細胞作對照，hMSCs主要高表達纖維連接蛋白1(FN1)和Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型膠原等細胞骨架蛋白基因;轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、基質細胞源性因子1(SDF-1)、脂肪分化相關蛋白和表皮生長因子受體(EGFR)等與多種方向細胞分化發育相關的細胞因子/受體基因。FN與細胞膜受體整合素間的相互作用是細胞黏附與遷移的重要機制，其分子中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位點是重要的結構基礎，可與多種細胞外基質及細胞表面受體相結合，增強細胞間、細胞與基質間的緊密接觸，影響細胞內骨架蛋白的組裝，增強細胞的定向遷移，從而影響細胞的生長分化。SDF-1基因編碼基質細胞來源的旁分泌家族成員，和受體CXCR4結合可活化血細胞，促進細胞的遷移和腫瘤的轉移［6］。

相反，hMSCs低表達的344個基因中，細胞信號和傳遞蛋白基因所占比例最大，如1-磷酸-鞘氨醇受體1(S1PR1)、CTNNB1、PDGFB 等;其次是細胞發育相關基因，如趨化因子受體4(CXCR4)、血管生成素2(ANG-2)、血管內皮生長因子(VEGF)等;再次是蛋白翻譯、合成基因，如vWF、CD34等。

趨化因子受體4(CXCR4)是CXC趨化因子SDF-1的特異性受體，兩者在卵泡生長、發育和血管新生過程中有重要作用［7］。VEGF可刺激內皮細胞CXCR4的表達，增加對SDF-1的反應性，促進新生血管的形成，其機制可能和VEGF刺激轉錄因子與CXCR4基因啟動子區域SP1位點的結合有關。β1連環蛋白(CTNNB1)是一重要的細胞黏附分子和信號傳導因子，與E-Cad結合后形成細胞內的黏著復合體，起轉錄激活作用，啟動細胞增殖相關基因轉錄，使細胞大量增殖。VEGF基因啟動子包含7個CTNNB1的結合位點，CTNNB1可調節VEGF的表達，兩者呈正相關關系［8］。PDGFB是PDGF家族成員之一，是間充質細胞的重要有絲分裂因子，在促進細胞增殖和血管生成方面有積極作用。因此，VEGF和PDGF成為近年來誘導MSCs內皮分化的首選誘導因子。

1-磷酸-鞘氨醇受體1(S1PR1)參與脂類分子信號轉導通路，激活后可誘導細胞間的黏附，是細胞內的信號傳導分子和促血管生成因子。S1PR1和配體SSP(鞘氨醇1-磷酸化酶)的結合具有高親和性、高特異性，并可激活多種信號轉導途徑，誘導與血管生成有關的反應［9，10］。血管生成素 -2(Ang-2)是血管生成素1和內皮細胞酪氨酸激酶(TIE-2)拮抗劑，所編碼的蛋白可阻止血管生成素1引起的血管重建，誘導內皮細胞凋亡。這些基因的功能雖然已有深淺不同的研究，但大多是在其他細胞或動物體內進行的。在骨髓間充質干細胞內，尤其是在間充質干細胞向內皮細胞分化過程中的作用和機制還有待進一步研究。

以上實驗研究可見，由骨髓間充質干細胞誘導成血管內皮細胞是可行的，但分化機制是相當復雜的，涉及多基因的表達變化，包括一系列細胞骨架蛋白的重構;不同方向細胞分化相關基因表達的下調;細胞信號和傳遞蛋白相關基因的表達增強以及內皮相關發育基因的上調，還涉及一些DNA結合、轉錄、轉錄因子基因和蛋白翻譯、合成相關基因的變化。這些差異表達的基因代表了一個與MSCs內皮分化相關的、特異的基因表達譜。正是這些基因的表達變化，使MSCs在各種內皮誘導體系的作用下表現出內皮細胞的抗原標志，甚至表現出內皮細胞的相關功能。

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