139例O型孕婦外周血DNA檢測胎兒血型準確度分析

馬紅麗 楊 波 王志紅 贠中橋

臨床上胎兒血型產前早期確定能夠預測母嬰血型不合妊娠的胎兒/新生兒溶血性疾病［1，2］。我們利用PCR-RFLP技術建立從O型孕婦外周血中提取DNA檢測胎兒血型的實驗方法并用該法對139例O型孕婦外周血進行檢測以研究該法檢測胎兒血型的準確度。

資料與方法

1.臨床資料:選擇2009年01月～2011年07月來自洛陽市婦女兒童醫療保健中心、河南科技大學第一附屬醫院、洛陽市中心醫院、河南科技大學第二附屬醫院、河南科技大學第三附屬醫院等多家醫療機構的孕婦139例，年齡23～42歲，懷孕期為13～32周期間，孕婦血型為O型，其丈夫血型為A型、B型或AB型。

2.試劑與儀器:DNA提取試劑盒(德國，QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen)，AluⅠ和KpnⅠ限制性內切酶(TaKa-Ra寶生物工程有限公司)，Taq DNA Polymerase、dNTPs(北京鼎國生物技術發展中心)，引物由上海生物工程技術服務公司合成，標準抗 A抗 B由長春生物制品公司生產，Marker(TaKaRa寶生物工程有限公司)。美國 PE公司生產的PE9700 PCR儀，Eppendorf AG Mini離心機，北醫LDZ5-2臺式低速自動平衡離心機，日本賀力士2420型號臺式冷凍高速離心機，德國XKP6-A簡潔型恒溫混勻儀，蛋白質核酸含量測定儀，美國伯樂100/5電泳儀，美國BIO-RAD公司Gel 100凝膠成像系統。

3.方法:(1)DNA提取 :按血樣DNA提取試劑盒說明書中血液或體液DNA提取方案“Blood and Body Fluid Spin Protocol”提取孕婦外周血 DNA［3］。(2)目的片段擴增:參照Yamamoto等［4］和 Lee等［5］的文獻進行引物設計，序列如下:F1:5'-GTCTACCCCCAGCCAAAGGTGC-3';F2:5'-AGTGCTTCTCCGCCGTCTCCA-3';F3:5'-GACTTCTGCGAGCGGCGCT-3';F4:5'-TAGGCCTGGGACTGGGGCC-3'。PCR反應體系為25μl:10×Buffer 2.5μl;(添加濃度)MgCl21.5μl;(添加濃度)dNTPs 2.0μl;引物各 3μl;模板 2μl;Taq 酶 1μl;ddH2O 10μl。以 F1、F2為引物進行 PCR反應的條件如下:95℃5min;95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，35 個循環;72℃7min;產物為1896bp的片段。以F3、F4為引物進行PCR反應的條件如下:95℃5min;95℃45s，54℃40s，72℃30s，35 個循環;72℃7min;產物長度為185bp。(3)酶切分析:用KpnⅠ酶切F1和F2的擴增產物，用AluⅠ酶切F3和F4的擴增產物。酶切反應體系為10μl:10 ×buffer 2μl;酶1μl;0.1%BSA 2μl;去離子水5μl，反應條件為37℃90min。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，判斷胎兒血型。(4)新生兒血型檢測:胎兒出生后抽取臍帶血用血清學方法檢測新生兒血型［6］。(5)計算孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與新生兒血清學血型檢測的符合率。

結 果

出生前孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與出生后檢測新生兒血型相一致的病例有131例，胎兒期DNA檢測血型與新生兒出生后檢測血型不相符的有8例。出生前后血型檢測符合率為94.24%。通過孕中期孕婦DNA檢測胎兒血型與新生兒出生后血型檢測的符合率為91.95%(80/87)，通過孕晚期孕婦DNA檢測胎兒血型與新生兒出生后血型檢測的符合率為98.08%(51/52)，隨著妊娠月份的增加新生兒出生前后血型檢測的符合率逐漸增加(表1)。

表1 139例O型孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與出生后新生兒血型符合率比較

討 論

ABO血型不合引起的新生兒溶血病(HDN)是由于胎兒和母親的血型不合所致，而大多數發生于O型孕婦所生的A型和B型嬰兒，因此，診斷對胎兒血型進行產前檢測可以確定該胎兒在出生時是否有患新生兒溶血病的可能，可為新生兒溶血病的預防提供可靠依據［7］。如果檢測胎兒血型為非O型，為了預防HDN的發生，我們將對該孕婦進行預防性治療，如果檢測胎兒血型為O型，將不會發生HDN，不必給予治療，從而避免了孕婦及其家庭不必要的經濟負擔和精神負擔。

通常確定胎兒血型的方法有:經腹取絨毛膜或羊膜腔穿刺取羊水或取臍帶血，或用免疫方法檢測胎兒血型物質的表面抗原，或利用這些物質中提取的胎兒DNA，通過分子生物學方法測定胎兒血型［8］。這些結果準確，但對孕婦來說均為有創性操作，而且有損傷胎兒的危險，還可能導致流產。因此，臨床上應用很謹慎，規定了嚴格適應證。

筆者利用PCR-RFLP技術建立了從O型孕婦外周血提取DNA檢測胎兒血型的方法，對139例丈夫為非O型的O型孕婦進行研究分析，新生兒出生前后血型檢測符合率為94.24%(131/139)。孕中期血型檢測與出生后檢測符合率為91.95%(80/87)，孕晚期血型檢測與出生后檢測符合率為98.08%(51/52)，隨著妊娠月份的增加新生兒出生前后血型檢測的符合率逐漸增加。

利用孕婦血漿中游離的胎兒DNA來進行產前診斷是一條可行的無創性檢測途徑［1，2］。該方法只需抽取少量的孕婦外周血就可進行，操作簡便，對孕婦和胎兒均無損傷。應用PCR-RFLP分析檢測血型，所需模板量少，花費時間短，經濟實惠且檢測結果準確度高，易于被患者接受，容易在臨床上推廣應用，因此對于母胎血型不合的診斷和新生兒溶血病的預防具有重要的價值和現實的指導意義。

1 Zolotukhina TV，Shilova NV，Voskobocva EY.Analysis of cell-free fetal DNA in plasma and serum of pregnant women［J］.Histochem Cytochem，2005，53(3):297-299

2 Saito H，Sckizawa A，Morimoto T，et al.Prenatal DNA diagnosis of a single-gene disorder from maternal plasma［J］.Lancet，2000，356:1170

3 Chin RW，Poon LL，Lau TK，et al.Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma［J］.Clin Chem，2001，47(9):1607-1613

4 Yamamoto F，Marken J，Tsuji T，et al.Cloning and characterization of DNA complementary to human UDPGalNAc:Fucal→2Gal→3GalNAc transferase(histo-blood group A transfrase)mRNA［J］.J Bio Chem，1990，265(2):1146-1150

5 Lee JC，Chang JG.ABO genotyping by polymerase chain reaction［J］.J FORENSIC Sci，1992，37(5):1269-1274

6 葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.南京:東南大學出版社，2006:246-251

7 蘭炯采，贠中橋，陳靜嫻.輸血免疫血液學實驗技術［M］.北京:人民衛生出版社，2011:163

8 王鋒良，張元珍.利用孕婦血漿中胎兒DNA檢測胎兒血型的意義［J］.武漢大學學報.2006，27(3):398