基于均勻設計的中藥有效組分復方配伍研究

楊鴻 吳彥 馬琰巖 呂俊海 李晶哲

隨著中藥現代化的發展，中藥的配伍組方研究已經從傳統的飲片層次上升到組分層次，中藥有效組分配伍已經成為中藥創新研究的一種新模式[1]，創新與延伸了方劑配伍理論。進行組分配伍研究的關鍵問題之一，是針對特定臨床疾病和藥效指標，如何獲得各組分的最佳劑量效應配比，從而能夠定量描述中藥組分與藥效之間的關系。由于中藥成分的復雜性和量效關系的非線性特征，與其相適應的研究優化方法需要具備非線性擬合能力，同時也要注重中藥組分配伍研究的高效性、實用性和可靠性。其中均勻設計適合于多因素多水平的實驗研究，能夠定量分析預測優化結果，在最佳劑量配比的確定方面發揮了較好的作用[2]。本文在前期單味中藥組分藥效研究[3]的基礎上，結合中醫理論指導，篩選銀杏葉提取物、淫羊藿總黃酮、黃芪總苷和甘草總黃酮組成了中藥組分復方，采用均勻設計結合改進最小角回歸(Improved least angle regression，Improved LARS)分析，以清除DPPH自由基能力為藥效評價指標，按照均勻試驗設計——藥效試驗——數學建模及模型驗證評價程序，進行了抗氧化中藥有效組分復方篩選評價的方法學研究探索，為探索適合中藥組效關系的研究方法提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及受試藥品

DPPH，美國SIGMA公司產品，批號S90790-379；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20091216。甘草總黃酮，規格90%，批號091015；銀杏葉提取物，規格24%黃酮和6%內酯，批號091015；淫羊藿總黃酮，規格70%，批號091108；黃芪總苷，規格50%，批號091015；均為南京朗澤醫藥科技有限公司產品。

1.2 儀器設備與軟件工具

DU730型蛋白核酸分析儀，美國BECKMAN公司產品；BT25S十萬分之一電子分析天平，德國Sartorius公司產品。

“組分優化軟件v1.0”由中國中醫科學院楊洪軍老師提供。

1.3 均勻設計實驗方案

按照水平數應大于因素數2倍的均勻設計原則，本實驗設計為4因素12水平，采用均勻設計方案U12(124)表進行劑量配比關系研究；4種中藥有效組分甘草總黃酮、銀杏葉提取物、淫羊藿總黃酮和黃芪總苷作為考察因子，根據實際需要，甘草總黃酮和銀杏葉提取物設計為12個劑量水平；淫羊藿總黃酮和黃芪總苷由于受限于劑量范圍較小，采用擬水平方式，設計6個劑量水平，循環一次達到12個水平。均勻試驗安排見表1。

1.4 中藥組分配伍清除DPPH自由基的測定方法[4]

DPPH自由基清除實驗是判定藥物體外抗氧化活性的經典實驗方法，具有靈敏度高，重復性好，誤差較小等特點，具體方法如下：

將DPPH用無水乙醇配置成濃度為25 mg/L備用。配置各實驗編組藥物濃度，使反應體系藥物總濃度恒定為0.05 mg/ml。在試管中依次加入2 ml DPPH溶液和0.5 ml 70%醇溶液(樣品溶解溶劑)，混勻后用1 cm比色皿在517 nm波長處測吸光值(A)，記為A0；加入2 ml DPPH溶液和0.5 ml待測中藥組分復方試液,混勻后在黑暗處靜置30分鐘，測定記為Ai；加入2 ml無水乙醇溶液和0.5 ml待測中藥組分復方試液,混勻后測定值,記為Aj，按下式計算自由基清除率。清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。進行三次重復實驗，清除率采用“均數±標準差”表示。

表1 U12(124)均勻試驗設計表

1.5 LARS回歸分析、多元線性回歸分析及中藥組分復方劑量配比優化結果驗證

根據實驗結果，分別采用Improved LARS分析方法、多元線性回歸分析方法，通過“組分優化軟件”，獲得四組分配伍清除DPPH的回歸方程，結合實際進行人工優化，獲得優化配伍結果，按照2.2方法再次進行優化配伍測試和驗證，獲得清除DPPH的最優配比，通過比較分析兩種回歸方法的差異。

2 結果

2.1 中藥有效組分配伍對DPPH自由基的清除作用

根據均勻設計和實驗檢測方法，四味中藥有效組分不同配比組合對DPPH自由基均有一定的清除作用，其中實驗2為實際清除DPPH效果最好的組合。實驗結果詳見表2。

表2 中藥組分均勻實驗配伍組合對DPPH清除率

2.2 均勻試驗結果的回歸分析

根據表2的實驗結果，采用Improved LARS和多元線性回歸分析分別獲得四組分配伍清除DPPH的回歸方程，其中甘草總黃酮為X1，銀杏葉提取物為X2，淫羊藿總黃酮為X3，黃芪總苷為X4，平均清除率為Y；從所建立的成分組合與藥效間的Improved LARS數學模型中看出，在清除DPPH自由基方面既有各有效組分的單獨作用，也有它們兩兩之間的交互作用，既可“增效”也有“拮抗”作用，能夠顯示出中藥多組分配伍的復雜性和非線性；而線性回歸方程僅顯示了各單個組分的作用，而沒有反應出組分間的交互影響。回歸方程如下：

(1)中藥組分配伍清除DPPH的LRAS回歸方程

Y=(1348.41024529341)×X1

+(1902.85081030458)×X2

+(0.432341713582079)×X3

+(-20.861132023621)×X4

+(-11511.5692665415)×X1×X2

+(6495.11575739643)×X1×X3

+(18840.5788500999)×X2×X4

+(1287.76729516979)×X1×X1

(2)中藥組分配伍清除DPPH的多元線性回歸方程

Y=(-1371.24900228961)

+(28648.4949869476)×X1

+(29276.1810839307)×X2

+(27530.7710541729)×X3

+(27748.8885934949)×X4

2.3 優化配伍結果及其驗證實驗

根據以上回歸方程并結合實際進行人工優化，獲得該中藥有效組分復方的2個優化配伍預測組合，同時為了驗證預測的準確性設計了另兩個配伍組合。將這四個組合和實際檢測最佳組合進行了清除DPPH的驗證實驗，結果顯示清除DPPH效果以預測A組合為最優(甘草總黃酮0.8 mg/ml、銀杏葉提取物3.144 mg/ml、淫羊藿總黃酮0.024 mg/ml和黃芪總苷0.036 mg/ml)，不僅優于均勻設計實際檢測最佳組合的清除作用，同時也要強于其組成各單味組分中藥的作用；實驗結果與通過Improved LARS和多元線性分析獲得的預測趨勢是一致的，在預測結果方面顯示兩種分析方法差別不大，然而從Improved LARS數學模型中能夠顯示出中藥多組分配伍的復雜性和非線性，而線性回歸模型則反應不出各組分間的相互作用。因此綜合看來，依據Improved LARS算法所建立的數學模型對中藥組分配伍來說更為適合。實驗結果見表3。

表3 中藥組分優化組合清除DPPH的預測和驗證結果

注：上述劑量為原始藥物配置濃度

3 討論與結論

在中藥有效組分復方的配伍研究中，用于定量描述中藥組分與藥理效應之間關系時，需要借助適宜的數學分析建模方法。目前，常用的中藥組分配伍優選設計方法有正交設計、均勻設計、基線等比增減設計、配伍計量分析法、藥對協同效應設計、極性分段篩選設計等[5-8]，各有特點：如正交設計具有試驗點分布均衡、整齊可比，但實驗次數較多等特點；基線等比增減設計、配伍計量分析法和藥對協同效應設計適合于兩種藥物的配比優化研究；極性分段篩選設計則適合于藥物極性有明顯差別的復方組分篩選。而針對目前日益增多的中藥有效部位和單體組分，該如何選擇合適的研究方法，切實有效的進行多組分中藥復方的配伍研究則日益迫切。本研究顯示均勻設計可以在最佳劑量配比確定方面發揮較好的作用，其優點在于適合多因素、多水平的實驗研究。在同等情況下，不僅試驗次數較正交設計大為減少，而且通過分析處理試驗數據，能夠定量分析各因素對試驗結果的影響，定量地預報優化條件及優化結果的區間估計。所采用的Improved LARS回歸數據分析方法，屬于一種非線性多元回歸算法，符合中藥復方量效關系研究中的非線性特征，對于偏差較大的數據依然能夠給出良好的擬合能力，符合生物實驗數據離散度較大的特點，適合“非線性、小樣本”的中藥多組分與生物效應間數據分析和關系描述。

本次研究根據均勻設計原理獲得了12組中藥組分不同配比的DPPH清除率數據，依據Improved LARS進行了數學分析建模，獲得了優化組合的預測清除率，驗證結果顯示最佳組合不僅優于均勻設計中實際檢測最佳組合的清除作用，同時也要強于其組成各單味組分中藥的作用。由于生物實驗自身的離散度等原因，不同批次實驗數據會有波動，但不同組合優劣排序與預測排序結果是一致的，說明該方法適合生物數據的分析，具有良好的預測性，用于中藥組分配比篩選是可行的。同時，在運用均勻設計進行組分配伍研究時需要注意以下問題：

(1)恒定配比藥物反應總量：由于在劑量配比研究中存在著量效關系的干擾，因此在使用均勻設計表安排配比實驗時需要排除這種影響，通過恒定每個組合在藥效反應體系中的總量，可以保證結果的客觀性和準確性。

(2)藥效評價指標的選擇：在效應評價過程中應選擇特異性高、生物離散度較低、重復性較好的定量指標，這樣獲得的回歸方程擬合性較好，預測最佳劑量配比準確度高。

(3)中藥作用具有多成分、多靶點特性，有效組分復方的總效應也非單一組分單獨作用的線性疊加，而是既可“增效”也可“拮抗”，顯示出配伍研究的復雜性和非線性特征。

參考文獻

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