滋腎通絡方對局灶性腦缺血大鼠腦組織腦源性神經營養因子蛋白含量的影響

王華 陳澤濤

缺血性卒中有發病率高、病死率高、致殘率高、復發率高的特點，目前在對神經細胞營養修復方面無切實可行的中西藥物，筆者通過多年的臨床觀察，研制出滋腎通絡方治療本病，取得明顯的效果。

腦源性神經營養因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是在腦內合成的一種蛋白質，它廣泛分布于中樞神經系統內，BDNF為一種堿性蛋白質，對神經元的存活、分化、生長發育起重要作用；并具有調節突觸可塑性和神經遞質傳遞等功能；同時，能防止神經元受損傷死亡、改善神經元的病理狀態、促進受損傷神經元再生及分化等生物效應。本實驗通過免疫組織化學法觀察局灶性腦缺血大鼠(MCAO)治療后腦組織BDNF的蛋白含量，以判斷滋腎通絡方對缺血周圍區神經細胞損傷修復的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠，體重250～300克，由山東大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK魯20030004。攝食飼料為山東大學動物實驗中心提供的混合飼料，實驗期間自由飲水，室溫18～25 ℃，相對濕度62%～72%。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型大鼠的制備 參照Zea-Longa[1]報道的頸外動脈栓線法制備局灶性大鼠腦缺血模型。Wistar雄性大鼠用1%戊巴比妥鈉45 mg/kg行腹腔注射麻醉，并取仰位固定；剪去大鼠頸部毛發后，常規碘伏消毒頸部皮膚，沿頸部正中切開，鈍性分離皮下組織，從兩側頜下腺之間剪開淺筋膜，暴露左側胸鎖乳突肌，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌肌之間的肌間隙，暴露左側頸總動脈(CCA)，沿此間隙繼續向上方分離，找到CCA分叉，在頸總動脈深面穿一細線，鈍性分離頸內、外動脈。提起該側CCA，在接近頸內動脈(ICA)與頸外動脈(ECA)分叉處，用眼科剪小心在CCA剪一約0.2 mm的橫切口，將一直徑約0.2 mm的魚鉤線(尼龍線)，穿入ICA，穿線前標記從動脈切口到眼外眥的距離，將魚鉤線緩慢穿入至接近標記位置，當感到有一定阻力時即停止推送，此時栓線進入距CCA分叉處約1.8～2.0 cm，頭端正好位于MCA起始部位，阻斷MCA血流，可見大鼠右眼虹膜顏色變淺，出現Honer’s征。然后將切口的遠心端及動脈內的絲線牢固結扎，剪去多余的絲線，逐層縫合皮膚，局部撒青霉素粉，將栓線的尾端暴露在皮外。術中及術后保持室溫25 ℃左右，采用60 W的白熾燈照射動物以維持其肛溫在(37.5±0.3)℃，相當于腦溫(37.9±0.4)℃左右。

1.2.2 動物分組 上述Wistar雄性大鼠50只，隨機分成5組，即模型組、假手術組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組各10只。假手術組僅把栓線插入ICA 6 mm而不入顱，術后不給予任何處理。

1.2.3 用藥方法 西藥組灌胃給予吡拉西坦片(南利民制藥有限責任公司生產，每片0.4 g，產品批號：0612146)，按50 mg/100 g大鼠/每日計算；中藥低劑量組、中藥高劑量組灌胃給予滋腎通絡方(由制首烏、白芍、生山楂、紅花按15∶12∶12∶5比例組成)水溶液2 ml(中藥低劑量組1 ml≈1.28 g生藥，中藥高劑量組1 ml≈2.55 g生藥)，按成人千克體重劑量的6倍、12倍給予；余二組分別灌胃給予生理鹽水2 ml，每天1次，共20天。于造模成功后24小時給藥，固體飼料和水自由攝取。

1.3 免疫組織化學染色及圖像分析

1.3.1 制片 上述MCAO模型大鼠灌胃20天后，麻醉后迅速斷頭，在低溫下取腦，將左側海馬部分腦組織迅速切成1.8 mm厚的冠狀腦片，置10%福爾馬林液固定，常規梯度酒精脫水后，石蠟包埋后進行連續切片，切片厚度約4 μm。

1.3.2 染色進行免疫組化染色 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘；3% H2O2去離子水孵育5～10分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性；滴加山羊血清工作液室溫孵育10～15分鐘，傾去，勿洗；再滴加適當比例稀釋的BDNF抗體，37℃孵育2～3小時或4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3分鐘；滴加生物素化二抗工作液，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；再滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗后用封片劑封片。

1.3.3 檢測方法 首先光鏡下觀察神經元出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。再在高倍鏡(×400倍)下每張切片隨機選取5個不重疊的區域進行拍攝，將圖像輸入到HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統內，在相同的背底倍體條件下選擇相應的參數進行計算機完全定量分析，用平均灰度值來表述BDNF的蛋白含量。

1.4 統計學處理

2 結果

各組腦組織BDNF蛋白表達的比較見圖1～5及表1。由圖1可見，假手術組海馬區BDNF切片染色很弱，幾乎無陽性細胞表達；圖2可見，切片染色增強，陽性細胞略有表達；圖3、圖4、圖5可見，西藥組、中藥低劑量組及中藥高劑量組均見到切片染色強，BDNF陽性細胞強表達，尤以中藥高劑量組陽性細胞表達最強。 由表1可看出， 模型組大鼠局灶性腦缺血后， 腦組織BDNF平均灰度值升高，但與假手術組比較無顯著性差異(P>0.05)；西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組腦組織BDNF平均灰度值較假手術組及模型組顯著升高(P值均小于0.01)。中藥高劑量組平均灰度值較中藥低劑量組及西藥組明顯升高(P<0.05)。

圖1 假手術組海馬區BDNF的表達

圖2 模型組海馬區BDNF的表達

圖3 西藥組海馬區BDNF的表達

圖4 中藥低劑量組海馬區BDNF的表達

圖5 中藥高劑量組海馬區BDNF的表達

組別平均灰度值假手術組113.42±23.23模型組118.64±16.27西藥組134.46±18.56ab中藥低劑量組135.32±16.42ab中藥高劑量組144.74±15.31abcd

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與西藥組比較，cP<0.05；與中藥低劑量組比較，dP<0.05

3 討論

腦梗死有病死率高、致殘率高的特點，在腦缺血損傷過程中，神經細胞損害與死亡是導致神經功能永久性喪失的重要因素。基于此，本研究開創滋腎通絡法治療本病，并用免疫組化法揭示實驗性大鼠腦梗死的發病機理及滋腎通絡方對模型動物神經細胞的保護作用和神經修復作用的影響。旨在改善臨床腦梗死的防治現狀，并為中醫藥防治該病提供分子水平的理論依據。

根據臨床多年治療缺血性中風的經驗，把滋補腎陰和活血通絡法結合起來，提出滋腎通絡是缺血性中風的基本治法，使腎精得復，腦髓得充，經絡暢通“補而不膩，通而不泄”，腦絡得以濡養。滋腎通絡方藥凡4味，由何首烏、白芍、山楂、紅花組成，是筆者多年在臨床觀察應用于缺血性卒中治療的經驗方。本方藥味雖少，但能充分體現滋腎通絡的治法，其制方遣藥，謹遵君臣佐使方意。

BDNF廣泛存在于腦內各組織，以大腦皮質、海馬、紋狀體分布最為豐富。BDNF在腦內對發育中的交感、感覺和運動神經元的存活、分化和增殖有促進作用[2-4]，并具有抗凋亡作用[5]。BDNF是唯一不斷的在中樞神經系統和周圍神經系統組織中表達的神經營養因子，它能促進神經元生存、延緩變性的自然死亡，參與腦缺血損傷的保護過程[6]。

本實驗研究表明，模型組大鼠局灶性腦缺血20天后BDNF表達反應性增強，說明BDNF與損傷后神經元的修復作用有關。經滋腎通絡方治療后BDNF表達顯著增強，特別是中藥高劑量組增強更明顯，與西藥組及模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。說明滋腎通絡方可通過調節BDNF的合成，促進神經細胞的存活和損傷修復，從而減輕缺血性腦損傷。

參考文獻

[1] Longa EZ,WeinsteinPr,Carlson,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke,1989,20(1):84-91

[2] Ying SX,Cheng JS.Effect of electro-acupunture on c-fos expression in gerbil hippcampus during transient global ischemia[J].Acupunct Electrother Res,1994,19(4):207-213.

[3] Barde YA,Edger D,Thoenen H.Puritication of a new neurotro- phicfactor from mammalian brain[J].EMBOJ,1982,1(5):549-553.

[4] Tsukahara T,Yonekawa Y,Tanaka K,et al.The role of brain derived neurotrophic fator in transient forebrain ischemia in the rat brain[J]. Neuro-surgery,1994,34(2):323-331.

[5] Pringle AK,Sundstrom LE,Wild GJ.Brain derived neurotrophic factor,but not neurophin-3,prevents ischemia induced neuronal cell death in orgenotypic rat hippocampus slice cultures[J].Neurosci Lett,1996,211:203-206.

[6] Endres M, Fan G, Hirt L, Fuji M, Matsushita K, Liu X, Jaenisch R, Moskowitz MA.Ischemic brain damage in mice after secretive modifying BDNF or NT-4 gene expression[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(1):139-144.