HPLC法同時測定熱毒清顆粒中綠原酸和連翹酯苷A的含量Δ

鮑涵，張忠義，張軍，黃寶明（.廣州中醫藥大學，廣州 50405；2.南方醫科大學珠江醫院，廣州 50280）

熱毒清顆粒由金銀花、連翹、大青葉、荊芥、鉤藤等15味藥材組成，具有疏風解表、清熱解毒、利咽止咳等功能，主治風熱兼濕型外感，癥見發熱、咽喉腫痛、咳嗽等。金銀花和連翹為君藥，綠原酸及連翹酯苷A分別為其指標性成分，其中綠原酸具有廣泛的抗菌活性[1，2]，還具有抗病毒[3]、抗炎解熱[4]等作用；連翹酯苷A具有很強的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、白色念珠菌有明顯的抑制作用[5]，且體外抑病毒作用較強，尤其對呼吸道最常見病毒合胞病毒具有明顯的體外抑制作用[6]，同時對活性氧具有較強的清除能力，是一種有效的天然抗氧化劑[7]。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定熱毒清顆粒中綠原酸和連翹酯苷A的含量，方法簡單、快捷，可用于熱毒清顆粒的質量控制。

1 儀器與試藥

LC-20A型HPLC系統，包括紫外檢測器、LC-20AT型泵、SIL-20A型自動進樣器、Lab solution色譜工作站（日本島津公司）；CP225D型萬分之一分析天平、AB204-N型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110753-200413）；連翹酯苷A對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，批號:100920）；熱毒清顆粒（南方醫科大學珠江醫院自制，批號:110509、110510、110511）；甲醇（色譜純，德國默克公司），液相用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫程序為0（22%A）→10min（30%A）→13min（34%A）→30min（34%A）→32min（22%A）→35min（22%A）；流速:1.0mL·min－1；檢測波長:330 nm；進樣量:10μL；柱溫:25℃。在此色譜條件下，綠原酸和連翹酯苷A分離度良好，空白無干擾。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品5.62mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品貯備液（每1mL含綠原酸0.562mg）。

圖1 高效液相色譜圖A.熱毒清顆粒；B.綠原酸對照品；C.連翹酯苷A對照品；D.連翹陰性對照；E.金銀花、鉤藤陰性對照；1.綠原酸；2.連翹酯苷AFig 1 HPLC chromatogramsA.reduqing granules；B.chlorogenic acid control；C.forsythoside A control；D.negative control of Forsythia suspensa；E.negative control of Lonicera japonica and Gambir Plant；1.chlorogenic acid；2.forsythoside A

精密稱取連翹酯苷A對照品4.11mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為連翹酯苷A對照品貯備液（每1mL含連翹酯苷A0.0822mg）。

精密量取綠原酸對照品貯備液、連翹酯苷A對照品貯備液各2.5mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含綠原酸0.1405mg、連翹酯苷A 0.0206mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“裝量差異”[8]項下的本品內容物，混勻，取適量，研細，取約1.5 g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別制備缺金銀花和鉤藤（綠原酸）或連翹（連翹酯苷A）的陰性顆粒，并按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液2、6、10、12、16、20μL，注入HPLC儀，每個樣品測定2次，記錄色譜峰面積。分別以綠原酸、連翹酯苷A進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得綠原酸的回歸方程為Y＝2663957.8586X－1738.8921（r＝0.9999）。結果表明，綠原酸進樣量在0.0562～0.5620μg范圍內與其峰面積積分值呈良好的線性關系；連翹酯苷A的回歸方程為Y＝1154713.1929X－819.0719（r＝0.9999）。結果表明，連翹酯苷A進樣量在0.0411～0.4110μg范圍內與其峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

分別精密吸取綠原酸和連翹酯苷A混合對照品溶液適量，微孔濾膜濾過，取續濾液，連續測定6次，記錄色譜峰面積。結果，混合對照品溶液中綠原酸平均峰面積為2457.3361，RSD＝0.30%；連翹酯苷A平均峰面積為615.6706，RSD＝0.24%，表明儀器精密度良好。

2.5 中間精密度試驗

采用戴安680型HPLC儀，Kromasil C18色譜柱進行試驗。精密吸取綠原酸和連翹酯苷A混合對照品溶液適量，微孔濾膜濾過，取續濾液，連續測定6次，記錄色譜峰面積。結果，綠原酸峰面積為6.9649，RSD＝0.83%；連翹酯苷A峰面積為1.9029，RSD＝0.72%，表明中間精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，測定綠原酸和連翹酯苷A的峰面積。結果，綠原酸平均峰面積為1126153.0，RSD＝0.25%（n＝6）；連翹酯苷A平均峰面積為371707.5，RSD＝0.53%（n＝6），表明供試品溶液在24h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品適量，平行制備6份供試品溶液，進樣測定。結果，綠原酸平均含量為1.2323mg·g－1，RSD＝0.97%；連翹酯苷A平均含量為1.1019mg·g－1，RSD＝1.12%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的熱毒清顆粒適量，共6份，分別精密加入綠原酸和連翹酯苷A對照品適量，按“2.2.2”項下方法操作，測定并計算綠原酸和連翹酯苷A的加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取熱毒清顆粒3批樣品（批號:110509、110510、110511）“裝量差異”[8]項下的內容物適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入HPLC儀中進行測定，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg·g－1）Tab 2 Content determination of samples（mg·g－1）

3 討論

連翹酯苷A作為一種酚性成分，一直以來都被視為連翹的主要有效成分，但其結構較為復雜，遇酸、堿或高溫等不穩定，易引起分解，所以對其含量進行檢測更加顯得重要[9]。本法流動相中采用0.1%磷酸溶液可以很好地提高組分的分離度，使連翹酯苷A和綠原酸分離度均＞1.5，可以同時直接測定這2個組分含量；改進了各組分色譜峰的峰形，改善峰的脫尾現象，拖尾因子在0.95～1.05范圍內；缺樣無干擾，方法專屬性良好。金銀花與連翹在中藥復方中多配伍使用，筆者以HPLC法同時測定熱毒清顆粒中有效成分綠原酸和連翹酯苷A的含量，分離效果理想，重復性好，簡便快捷，可用于熱毒清顆粒的質量控制。

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