煙草根際解鉀菌的篩選與鑒定

劉 璇，孔凡玉，張成省，王 靜，馮 超，趙 杰

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

鉀幾乎可以參與煙株體內所有的代謝過程[1]，對煙株的物質代謝和能量代謝有很大的影響。增施鉀肥和提高土壤中鉀的有效性是提高煙葉鉀含量的有效途徑[2-3]。然而，我國鉀肥資源較為匱乏，而且單純增施鉀肥并不能提高煙葉中的鉀含量[4-5]。因此，開辟新的效果好、成本低且不污染環境的解鉀菌，充分利用土壤中的鉀素資源，對發展生態、經濟農業具有十分重要的意義。

解鉀菌能夠將土壤中的固定態鉀分解，轉化為作物可以直接吸收利用的有效鉀，而且它分泌的一些活性物質可以促進植物的生長。因此解鉀菌是理想的生物肥料[6-7]。

本研究對解鉀菌進行了解鉀能力測定和菌種鑒定，探討了解鉀菌是否可以增加培養液中可溶性鉀的含量，以期為制成煙草大田解鉀菌菌肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：山東省青島市即墨采集的煙草根際土壤。鉀源：鉀長石。分析純試劑：NaH2PO4，MgSO4·7H2O，FeCl3，蔗糖，CaCO3。生化試劑：瓊脂，牛肉膏，蛋白胨。主要儀器：超凈工作臺，離心機，光焰光度計，高壓滅菌鍋，搖床。解鉀細菌培養基：NaH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeCl30.05 g，蔗糖5.0 g，CaCO30.1 g，鉀長石粉1.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 方法

本試驗于2010年9月在中國農業科學院煙草研究所即墨基地進行，從煙草根際土壤中分離篩選出解鉀菌。

1.2.1 鉀細菌的分離純化 取根際土樣 1 g放入100 mL解鉀細菌培養基的三角瓶中，28 ℃下進行搖床培養72 h。采用10倍稀釋法，制成10-1～10-7稀釋度懸液。

取上述制成10-3～10-7稀釋度的根際菌懸液50 μL在解鉀細菌培養基上涂布，每一稀釋度 3個重復。在28 ℃溫箱中培養，以鉀細菌的菌落形態（呈玻璃珠狀，透明，凸出，挑取時有勃稠感等）為標準進行挑取，進一步純化，選取長勢較好的菌株保藏，以便用于進一步研究[8]。

1.2.2 解鉀菌的速效鉀產生能力測定 解鉀細菌的搖床培養：將配好的鉀細菌液體培養基按每瓶50 mL的裝量加入250 mL的三角瓶中，0.1MPa，20 min滅菌，冷卻后接進1 mL解鉀菌液，并設置不接種的空白對照。接種后，28 ℃、150 rpm振蕩培養7 d。

上清液速效鉀測定：將在三角瓶中培養好的鉀細菌發酵液倒出并定容至50 mL，將發酵液在500 rpm下離心10 min，除去發酵液中的不溶性物質，然后取10 mL的菌液10000 rpm離心10 min，取上清液測定水溶性鉀含量[9]。

1.2.3 解鉀菌的16S rDNA鑒定 模板DNA的提?。喝ゼ毦囵B物1～5 mL（106～108個細胞，最多不超過2×109個細胞），10000 rpm離心1 min，棄凈上清。向沉淀中加入180 μL Buffer GTL，震蕩使菌體重懸。

加入20 μL Proteinase K，渦旋混勻，70 ℃孵育直至菌體完全裂解，孵育過程中每隔一段時間顛倒或震蕩離心管使樣本分散。

渦旋振蕩15 s，加200 μL Buffer GL ，渦旋振蕩充分混勻；加200 μL 無水乙醇，渦旋振蕩充分混勻（加入Buffer GL和無水乙醇后可能產生白色沉淀，不會影響后續實驗）。

將上一步所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入Spin Column DM中（Spin Column DM已放入Collection Tube），8000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

向Spin Column DM中加入500 μL Buffer GW1（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），8000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

向Spin Column DM中加入500 μL Buffer GW2（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），14000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

14000 rpm離心2 min，棄廢液。將Spin Column DM置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的Buffer GW2。

將Spin Column DM轉入一個新的離心管中，向膜的中間部位懸空滴加200 μL Buffer GE，室溫放置1～5 min，8000 rpm離心1 min，將溶液收集到離心管中。-20 ℃保存DNA。

反應使用的上游引物為：

反應使用的下游引物為：

反應體系（50 μL）

由上海英駿生物技術有限公司北京測序部測序。

2 結 果

2.1 菌落基本特征

初篩選菌落28 ℃在篩選培養基上培養48 h得到8個典型菌落，并進一步純化菌落28 ℃在篩選培養基上培養48 h，菌落特征見表1。

表1 菌落形態與菌體基本形態特征Table1 The morphology colony and basic characteristics of morphological

2.2 速效鉀產生能力

利用鉀長石為唯一鉀源篩選培養基從植物根際土壤中篩選具有分解鉀礦的微生物，對所得到 8個菌株，分別擴大培養進行解鉀實驗，以 CK（不接種）作為對照，各接種培養液中速效鉀增加百分比見圖1。

所選菌株中以菌株 K-GX4的產生速效鉀能力最強，其培養液中速效鉀含量增加 174.2%，K-XHJ3、K-JM-J5、K-GX5、K-GX1次之，培養液中速效鉀含量增加分別為 146.99%、123.21%、121.23%、101.73%。培養液中速效鉀含量增加小于100%的菌株為K-JM-B2、K-GX6、K-JM-B1，其速效鉀含量分別增加79.27%、47.25%、24.51%。

圖1 速效鉀增加量百分比Fig.1 Increase in the percentage of available potassium

2.3 16SrRNA基因序列分析

將測序結果輸入Gen-Bank，利用BLAST軟件，將測定得到的基因序列與 GenBank數據庫中的序列進行同源性分析，獲取同源性較高的相鄰的種、屬的16S rDNA序列，得到結果如表2所示。

表2 GenBank中Blast得到8種的菌株的結果Table2 The result of 8 strains in GenBand

3 討 論

從青島即墨煙草根際土壤中篩選到的8株解鉀菌，通過測定各菌株培養液中鉀含量來評價其解鉀能力。其中以變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）產生速效鉀解鉀的能力最強，以產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、成團泛菌（Pantoea agglomerans）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）4種菌解鉀能力較強，較弱的為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）、Microbacterium foliorum、擬香味類香味菌（Myroides odoratimimus）。而且62.5%的菌株的培養液中速效鉀含量增加超過100%。

同實驗室富營養的培養條件相比，自然條件下的細菌往往處于“饑餓”狀況，而這正是細菌在自然界生活的正常環境。解鉀細菌和其他細菌一樣，在自然條件下極易受到環境條件的影響，如植物的種類、土壤肥力、水分、日長、光照強度、生長季節的長短、溫度的變化以及其他土壤微生物和原生動物的影響，這些條件中的任何一個發生變化，都有可能直接或間接地影響解鉀菌的生長。因此，盡管本研究所篩選到的解鉀菌株都具有分解鉀長石礦粉的能力，但在自然環境條件下情況十分復雜，若再通過盆栽試驗和大田試驗相結合的方法，從改善土壤生態環境、提高肥料利用率，改善烤煙根際營養水平、增強根系吸收能力，合理平衡、協調各生育期的營養及代謝狀況等方面進一步研究確認后，即可作為制作微生物肥料優先選用菌。

將解鉀菌制成生物肥料可增加煙草根際可溶性鉀的含量，有利于煙草鉀元素的吸收，從而提高煙葉產量和煙葉品質。煙草生物肥料具有無毒、無害、無污染、肥效長、節約能源等無機肥料所不及的優點[10]。從發展趨勢看，生物肥料在現代農業生產中將發揮越來越大的作用，代表著未來肥料發展的方向。

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