絨毛狀煙草BAC文庫的構建

高曉明，陳艷玲，劉貫山，李鳳霞，王衛峰，任媛媛，孫玉合*

（1.中國農業科學院煙草研究所，農業部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.華大基因研究院，深圳 518083）

近年來，越來越多物種的全基因組已被測序。此為重要基因的克隆、系統進化和基因組學研究提供了堅實的平臺。構建細菌人工染色體文庫（BAC）是全基因組測序的一個重要環節[1-2]。BAC文庫具有插入片段大、嵌合率低、遺傳穩定性好、易于操作等優點而備受青睞。目前已經在棉花[3-4]、水稻[5-6]、玉米[7]、大豆[8-9]、高粱[10]、黍[11]和番茄[12]等作物中建立了BAC文庫，為測序、基因圖位克隆、分子標記、物理作圖、基因結構和調控等研究提供了一個重要的技術平臺。建立絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）的BAC基因組文庫，對煙草基因功能、次級代謝途徑的研究等均有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為中國農業科學院煙草研究所基地種植的絨毛狀煙草。BAC克隆載體采用Epicentre公司的 CopyControlTMBAC Cloning Kit(Hind III)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞核 DNA 的制備 -80 ℃冷凍保存的嫩葉50 g，液氮研磨約30 min至粉末狀，加入500 mL預冷的NIBM（10% TKE，1 mM spermidine，1 mM spermine，0.2%β-巰基乙醇），間歇性輕輕攪拌約15 min。先后用4層紗布和1層miracloth過濾；濾液中加入 1/40體積的 NIBT（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine，20% Triton X-100），間歇性輕輕攪拌10 min，4 ℃ 2000 g 離心15 min；棄上清，用 50 mL預冷的 NIBM 重懸沉淀，兩層miracloth過濾，4 ℃ 2000 g 離心15 min。重復該操作5次。棄上清，用1 mL NIB（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine）重懸沉淀，45 ℃水浴2～5 min，與用NIB配制的，并經45 ℃水浴的1.5%低熔點膠等體積混合。混勻后轉移至模具中，冰上放置30 min形成plugs。制備好的plugs轉移至50 mL離心管中，加入20 mL lysis buffer [0.5 M EDTA（pH 9.2），1% lauryl sarcosine，過濾滅菌，加入蛋白酶K至0.3 mg/mL，混勻，50 ℃水浴24 h。倒掉lysis buffer，重新加入新鮮的lysis buffer和蛋白酶K，50 ℃水浴 24 h。倒掉處理液，加入 1×TE（pH8.0），4 ℃冷庫震蕩30 min。倒掉處理液，加入1×TE（pH 7.6），4 ℃冷庫震蕩30 min。倒掉處理液，加入含0.2 mM PMSF的10 mL TE緩沖液（pH 7.6），室溫靜置30 min，重復該操作2次。加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃冷庫震蕩30 min，重復該操作2次。plugs加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃保存或用于酶切。

1.2.2 大片段DNA的獲得 按照1個plugs在3 mL buffer1（V1×HindⅢ buffer：V1M spermidine：V1M DTT= 3000：6：1）中4 ℃平衡2次，每次30 min的要求，平衡6個plugs。將每個plugs分割成等大的12份，將每4小份的plug加入裝有 buffer 2（1×HindⅢ buffer 170 μL；1 M spermidine 0.34 μL；1M DTT 0.17 μL，10 mg/mL BSA2 μL 和1.6 U的HindⅢ）的1.5 mL離心管中，共18管，冰上平衡1.5 h，37 ℃水浴8 min；加入1/10體積的0.5 M EDTA（pH8.0），4 ℃放置30 min；脈沖場電泳進行膠回收，電泳分為2個Block。Block1：起始脈沖時間90 s，終止脈沖時間90 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時間14 h；Block2：起始脈沖時間5 s，終止脈沖時間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時間2 h。電泳結束后切下100～150 kb部分和150～200 kb部分。所得膠條經透析后進行二次脈沖場凝膠電泳，電泳條件為起始脈沖時間5 s，終止脈沖時間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時間14 h。切膠回收，脈沖電泳透析，將透析袋中溶液用于連接。

1.2.3 大片段DNA與BAC載體的連接與轉化 連接體系如下：DNA12.5 μL（25 ng），載體 0.75 μL（18.75 ng），純化水8.5 μL，混勻，55 ℃ 10 min，RT 15 min，再加入 10×Ligase Buffer2.5 μL，100 mM ATP0.25 μL，2 U/μL Fast link ligase 0.5 μL，16 ℃連接16 h；連接液中加入0.4 μL 0.5 M EDTA（pH8.0）和 0.4 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，混勻，37 ℃水浴1 h；加入0.4 μL 100 mM PMSF，混勻，RT 1h；將連接液點在0.025 μm Millipore膜中間，置于含冰冷純化水的平皿中，脫鹽2 h。將2 μL連接產物和20 μL感受態細胞EPI 300混勻，電擊轉化，吸出轉化液，迅速加入900 μL SOC液體培養基，吸打混勻；搖床180 rpm，37 ℃復蘇60 min。取300 μL復蘇液均勻的涂布在LB（用前涂100 μL VX-gal：VIPTG= 1：4混合液）上，37 ℃培養過夜。

1.2.4 BAC單克隆插入DNA片段大小的鑒定 隨機挑取單克隆，分別接種于3 mL LB液體培養基，200 rmp，37 ℃，震蕩培養過夜，提取質粒DNA，Not I酶切后進行脈沖場電泳檢測，電泳條件為：起始脈沖時間0.1 s，終止脈沖時間40 s，溫度14 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時間14 h。計算平均插入片段和空載率。

1.2.5 單克隆的挑取與保存 取白斑，接種于含有凍存緩沖液的細菌培養板中，37 ℃，培養16 h，用鋁箔封好，-80 ℃保存。

2 結 果

2.1 高質量高濃度細胞核DNA的制備

高效連接的 BAC克隆很大程度上取決于核DNA包埋膠塊plug中核DNA的濃度和純度。由于煙草葉片組織中含有較多的酚類等次級代謝產物，大大降低了細胞核DNA質量，因此本試驗選用煙草幼嫩組織為材料來制備高分子量DNA，幼嫩組織代謝產物少。制備細胞核 DNA時按照常規方法NIBM溶液中β-巰基乙醇的濃度為0.15%，攪拌10 min，制備出的plug顏色為微微的乳黃色，半透明，說明仍含有來自葉片的酚類物質以及細胞壁殘渣，這些殘留的物質會降低后續酶切的消化效率。因此試驗中將β-巰基乙醇的濃度調整為0.2%，攪拌15 min，制備出的plug為無色透明，這說明得到的核DNA比較純凈，提高了核DNA的質量。

2.2 BAC文庫的質量檢測

2.2.1 插入片段大小分析 用限制性核酸內切酶HindIII，對包埋的煙草高分子量核DNA進行消化，通過調節酶切時間及酶濃度，就可以獲得長度適合建庫的高分子量核 DNA。在進行大規模的酶切之前，先通過小范圍的酶切試驗確定最佳的酶切時間和酶濃度。隨機挑取100個單克隆，提其質粒并酶切鑒定插入片段大小。結果表明：插入片段分布在50～200 kb之間，平均插入片段約為110 kb，空載率＜2%（圖1）。

圖1 插入片段Not I酶切檢測Fig.1 PFGE analysis of insert size of the randomly picked clones

2.2.2 BAC克隆穩定性分析 隨機挑取15個BAC單菌落，連續培養100代；提取第0代和第100代的BAC質粒DNA，分別進行EcoR?酶切，進行脈沖場電泳檢測。結果表明，經繼代培養后，BAC克隆的酶切帶形一致（圖2）。說明BAC克隆中的插入片段至少可以穩定遺傳100代。

圖2 繼代穩定性EcoR?酶切檢測Fig.2 Stability analysis of BAC clones

3 討 論

煙草作為重要的經濟作物，在農業經濟和國際貿易中占有重要地位。目前生產上應用最普遍、經濟價值最大的栽培種普通煙草[Nicotiana tabacum(SSTT，2n=4X=48)]，是由林煙草[N.sylvestris (SS，2n=24) ]和絨毛狀煙草(TT，2n=24)種間雜交形成的一個不育的雜交種，經染色體加倍后形成的可育異源四倍體，進化成為現在的商業化栽培種。絨毛狀煙草是普通煙草的原始親本之一，基因組大小約為 2300 M。在確定絨毛狀煙草的全基因組序列后，可以更加方便地確定其它煙草屬內其它種的基因組序列，從而掌握普通煙草及其近緣野生種的完整序列信息。

目前大片段文庫構建技術已經十分成熟，但是相對于普通文庫的構建來說，依然存在技術上的難點。高質量高濃度的細胞核DNA插入片段的制備是 BAC文庫能否構建成功的最基本條件。植物材料的選取直接影響細胞核的質量。本試驗所用材料取自田間幼嫩葉片，葉綠體含量低，酚類及其它次級代謝產物含量低，很好地保證了試驗所需細胞核的質量。為減少提取過程中細胞核的物理損傷和防止高分子量DNA的物理打斷，植物組織研磨不能太細，包埋細胞核的操作及酶切、連接的操作必須動作輕柔，使用廣口槍頭。

高分子量的大小均一的插入片段是構建 BAC文庫最關鍵的環節之一[13-14]，設計一系列小規模酶切試驗以確定最佳酶切時間和酶濃度是十分重要的。Karutoyo等[15]的研究結果表明，如果酶用量過大可能導致非特異性酶切，這種非特異性酶切雖然在整個酶切反應體系中發生的幾率很小，但結果卻會產生很高比例的假陽性，從而導致整個文庫的空載率過高。

在連接反應中，盡量避免在插入片斷中混有小片段。片段太小建庫的重復次數、克隆保存數等就會增加很多。片段太大會降低連接轉化效率。

轉化反應也是重要步驟之一。整個轉化過程越快越好，操作要熟練，動作越快轉化效率越高。同時，轉化環境要求低離子強度，故在連接反應之后要對連接產物進行脫鹽處理。Allouis等[16]的試驗表明，轉化條件是影響大片段基因組文庫插入片段大小的關鍵因素。BAC載體理論上可以攜帶 300 kb的外源基因片段，但現在所有的 BAC文庫平均插入片段在150 kb左右，可見優化目前的轉化條件以提高插入片段的大小是急需解決的問題。

本試驗成功地構建了絨毛煙草 BAC文庫，為進一步克隆重要功能基因提供了必備的物質平臺。

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