杜香黃酮提取純化工藝及其抗炎作用研究

趙 頔， 張 敏， 武文斌， 瞿偉菁

（華東師范大學生命科學學院，上海 200062）

杜香黃酮提取純化工藝及其抗炎作用研究

趙 頔， 張 敏， 武文斌， 瞿偉菁*

（華東師范大學生命科學學院，上海 200062）

目的 探討杜香黃酮的提取純化方法及其抗炎活性。方法 以蘆丁為標準品定量分析杜香黃酮提取物，采用L9（34）正交試驗設計，考察含乙醇量、提取溫度、溶液體積、提取次數等因素對杜香粗黃酮浸提效果的影響。進一步以大孔樹脂吸附純化粗黃酮，探究吸附純化的最佳工藝條件；并研究其對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性提高、二甲苯致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠致小鼠氣囊炎的抑制作用。結果 在提取4次，每次1 h，溶劑體積40倍，提取溫度80℃，含乙醇量60%的條件下所得的提取液濃縮后，用HPD600樹脂過柱純化；純化的技術條件為：洗脫含乙醇量60%，洗脫體積/柱體積比3∶1，吸附時間4 h，加樣量/大孔樹脂投量比1∶20，體積流量7 mL/min。最終獲得的晶體得率為1.7 g/100 g生藥，晶體中黃酮純度達88.0%。杜香黃酮在體外實驗中可顯著抑制小鼠腹腔毛細血管通透性提高、小鼠耳廓腫脹，并降低氣囊炎內灌洗液總蛋白數及血清中NO水平。結論 杜香黃酮具有較好的抗炎活性。關鍵詞：杜香黃酮；提取；純化；抗炎

杜香Ledum palustre L.var.palustre為杜鵑花科杜香屬植物，又稱喇叭茶，白山苔等，我國野生資源豐富，主要分布在大小興安嶺、長白山等地區［1］。杜香能產生豐富的次生代謝產物，其揮發油具有鎮咳、祛痰，平喘、降壓、擴張血管、殺菌止癢、促皮吸收的藥理功效［2］；作為香料品種，已運用于日用化工、制藥皂、洗發香波等［3-4］。關于杜香提取物的報道也證明其具有抗氧化［5］，遺傳損傷的保護作用［6］。又有文獻報道杜香甲醇提取物能顯著抑制小鼠足趾水腫，且其中黃酮類化合物質量分數達 （29.3±8.5）%［7］。而黃酮類化合物是一組具有抗炎［8］、鎮痛［9］、抗癌［10］、改善糖脂代謝［11］等顯著作用的生物活性物質。本實驗將杜香中黃酮類化合物作為一個有效成分組合為基礎，對杜香黃酮提取純化的最優工藝條件進行探索。

炎癥是在致炎因素作用下，由炎癥細胞及其釋放的炎癥介質參與引起的一系列病理生理過程［12］。在這一系列過程中，致炎因素會造成毛細血管擴張，通透性提高，中性粒細胞趨化并游走至炎癥反應部位，釋放炎癥介質參與炎癥反應［13］，并產生活性氧自由基［14］。鑒于此，本實驗采用冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性提高、二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致小鼠氣囊炎模型，評價杜香黃酮的體外抗炎活性，為杜香黃酮的深度研究和藥用開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 新鮮杜香，吉林省白河林業局；ICR小鼠 （滬動合證字152號），上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；蘆丁、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、氯化鈉均為國產市售；HPD600大孔樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司；角叉菜膠，Sigma-Aldrich公司；依文思藍，國藥集團化學試劑有限公司；NO、SOD、MDA檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術研究所；醋酸地塞米松片，上海醫藥 （集團）有限公司信誼制藥總廠（國藥準字H31020793，規格0.75 mg）。

1.2 儀器與設備 DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；722光柵分光光度計，上海市第三分析儀器廠；高速臺式離心機，上海市離心機械研究所；RE—52型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；梅特勒-托利多BL系列電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Bio-tek exl 800酶聯免疫測定儀，美國Bio-Tek公司；恒流泵，上海滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 預處理杜香 使用粉碎機將干燥后的杜香打成粉末，過篩后，在70℃水浴，10倍體積石油醚的條件下回流脫脂。常溫下揮干石油醚，避光保存以備用。

1.3.2 黃酮定量的測定方法 以蘆丁作為標準品，采用硝酸鋁顯色法在510 nm波長處測定OD值，繪制質量濃度-OD標準曲線。樣品中黃酮定量測定按相同的步驟進行，根據標準曲線得到樣品中黃酮含有量［15］。

1.3.3 杜香黃酮最佳浸提條件的確定 按照正交實驗設計條件使用乙醇浸提，提取時間為每個樣品1次1 h，提取液經旋轉蒸發儀濃縮，烘干后得晶體，稱質量，避光保存。

1.3.4 杜香黃酮最佳純化條件的確定 使用HPD600大孔樹脂進行純化吸附，以杜香黃酮得率為依據，綜合考慮加樣量/大孔樹脂投量比，醇洗脫液體積，吸附時間及洗脫含乙醇量4個因素作為設計正交實驗的條件，從而選擇最優的純化條件。杜香黃酮得率=（洗脫液烘干后晶體質量/上柱前晶體質量）×100%；杜香黃酮純度=（洗脫液烘干后晶體內黃酮含有量/洗脫液烘干后晶體質量）×100%。

1.4 杜香黃酮體外抗炎活性的測定

1.4.1 對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響［16］ICR小鼠雄性40只，體質量 （20±2）g，隨機分為4組：模型組、陽性組 （地塞米松1.8 mg/kg）、杜香黃酮劑量組 （50 mg/kg、100 mg/kg）。連續灌喂給藥7 d，每天1次，模型組給予相等劑量生理鹽水。各組末次給藥30 min后于小鼠尾靜脈注射0.5%依文思藍生理鹽水溶液0.1 mL/10 g，20 min后脫頸椎處死，腹腔注入5 mL生理鹽水，輕揉腹部1 min后剪開腹部吸出洗滌液，1 500 r/min離心10 min，取上清液在590 nm處測定OD值。計算各藥物組的炎癥抑制率。

1.4.2 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響［16］ICR小鼠雄性50只，體質量 （20±2）g，分組及給藥劑量同上，增加杜香黃酮高劑量組 （200 mg/kg）。連續灌喂給藥7 d，每天1次，模型組給予相等劑量生理鹽水。各組于末次給藥30 min后將0.05 mL二甲苯涂于小鼠右耳耳廓，左側不涂作為對照。致炎30 min后處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑4 mm的打孔器打下左右耳同一部位的圓片，在分析天平上稱質量，計算兩耳的質量差記做耳廓腫脹程度，用來比較藥物的抗炎作用。

1.4.3 對角叉菜膠致小鼠氣囊炎的影響 按Ghosh［17］法略作修改，取60只雄性ICR小鼠，隨機分為6組：空白組、模型組、陽性對照組、以及杜香黃酮低、中、高 （50、100、200 mg/kg）劑量組。正常飼養一周后，除空白組和模型組給予同等生理鹽水外，每組動物均連續灌胃給藥。于給藥當天在小鼠背部肩胛區皮下注入空氣5 mL，接下來幾天維持氣囊的膨脹度，并在末次給藥后在小鼠背部氣囊內注入2%角叉菜膠2 mL誘發炎癥，空白組注入相應體積生理鹽水，3 h后再給藥1次，于致炎6 h后處死，眼眶取血，離心備用；在背部氣囊中注入2 mL生理鹽水灌洗液，立刻背部朝下，輕揉氣囊后收集灌洗液，測定總蛋白含有量。

2 結果與分析

2.1 杜香黃酮提取工藝的正交實驗結果分析 表1顯示為正交提取杜香黃酮的結果，以黃酮含有量作為參考標準，當提取溫度80℃，提取4次，含乙醇量50%，料液比1∶40時，得到的黃酮含有量最高，達53.98%。根據極差分析可知，從大到小依次影響杜香黃酮提取的各因素為：提取次數＞溶液體積＞含乙醇量＞提取溫度。結合各個單因素的提取均值分析，使用60%乙醇浸提可得的杜香黃酮含有量最高，且60%乙醇也是一般提取黃酮常用溫度，所以綜合確定提取條件為提取4次，每次1 h，溶劑體積40倍，含乙醇量60%，提取溫度80℃。

表1 杜香黃酮提取工藝L9（34）正交實驗結果

2.2 HPD600對杜香黃酮純化工藝的正交實驗結果分析根據表2數據可知，杜香黃酮得率最高的條件為加樣量/大孔樹脂投量比1∶5，吸附時間4 h，洗脫體積/柱體積比3∶1，含乙醇量60%。極差分析表明各因素影響力大小分別是：洗脫含乙醇量＞洗脫體積/柱體積比＞吸附時間＞加樣量/大孔樹脂投量比；結合各個單因素提取均值分析，大孔樹脂投量越多，其吸附杜香黃酮越充分，解吸附的量也隨之增加。故最終的純化工藝條件為：洗脫含乙醇量60%，洗脫體積/柱體積比3∶1，吸附時間4 h，加樣量/大孔樹脂的投量比1∶20。

表2 不同洗脫條件對杜香黃酮得率的影響

2.3 對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響 以測定所得的OD值及計算所得的炎癥抑制率進行評價，地塞米松與杜香黃酮劑量組均能顯著地抑制小鼠腹腔內炎性物質的滲出；與模型組比較，陽性藥組與100 mg/kg杜香黃酮組均出現極顯著性差異 P＜0.01，且杜香黃酮100 mg/kg劑量組的抑制率為54.59%，效果高于陽性藥物作用。結果見表3。

表3 對冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響（±s，n=10）

表3 對冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/（mg·kg-1）上清液OD值（±s）抑制率/%模型組 — 0.265±0.068—地塞米松組 1.8 0.141±0.049＊＊ 46.79杜香黃酮組 50 0.175±0.040* 34.06杜香黃酮組 100 0.120 ±0.051＊＊54.59

2.4 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 以耳廓腫脹程度及腫脹抑制率進行評價，實驗結果見表4，地塞米松組與杜香黃酮各劑量組均能降低小鼠耳廓腫脹程度，其中高劑量組的抑制率達30.27%，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n=10）

表4 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/（mg·kg-1）腫脹程度（±s）抑制率/%模型組 — 4.48±0.95—地塞米松組 1.8 2.78±0.92* 38.05杜香黃酮低劑量組 50 3.17±0.92 29.29杜香黃酮中劑量組 100 3.51±1.03 21.60杜香黃酮高劑量組 200 3.12±0.60*30.27

2.5 對角叉菜膠致小鼠氣囊炎的影響 由表5，6結果可知，經角叉菜膠致炎后，杜香黃酮能降低炎癥介質滲出，其中杜香黃酮高、中劑量組與模型組相比能顯著降低小鼠氣囊滲出液中總蛋白含有量 （P＜0.05），同時降低血清中MDA水平，增強SOD活性；同時，杜香黃酮中劑量組與模型組相比，還能抑制血清中NO的水平 （P＜0.01），提示杜香黃酮具有一定的抗炎活性。

表5 對氣囊炎小鼠血清SOD活性及MDA、NO水平的影響（±s，n=10）

表5 對氣囊炎小鼠血清SOD活性及MDA、NO水平的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/（mg·kg-1）SOD活性/（U·mL-1）MDA/（nmol·mL）-1 NO/（μmol·mL-1）正常組 — 176.75±20.99＊＊ 4.31±0.70＊＊ 18.16±5.76＊＊模型組 — 130.15±11.36 7.64±1.70 39.24±11.02地塞米松組 1.8 159.35±16.80＊＊ 5.00±0.24* 21.24±7.58＊＊杜香黃酮低劑量組 50 140.31±12.27 5.87±1.58 33.07±11.53杜香黃酮中劑量組 100 142.44±29.12 5.40±1.54 18.67±7.71＊＊杜香黃酮高劑量組 200 150.14±8.26＊＊ 5.01±0.82*28.22±7.26

表6 對氣囊炎小鼠氣囊灌洗液蛋白量的影響（±s，n=10）

表6 對氣囊炎小鼠氣囊灌洗液蛋白量的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/（mg·kg-1） 總蛋白/（mg·mL-1）正常組 — 0.13±0.04＊＊模型組 — 0.47±0.19地塞米松組 1.8 0.27±0.06*杜香黃酮低劑量組 50 0.39±0.23杜香黃酮中劑量組 100 0.28±0.15*杜香黃酮高劑量組 200 0.26±0.10*

3 結論

本實驗采用L9（34）正交實驗對杜香黃酮的浸提及純化條件進行研究，結果表明提取杜香黃酮的最佳條件為提取4次，每次1 h，料液比1∶40，60%乙醇，提取溫度80℃。將提取液濃縮后，用HPD 600型大孔樹脂過柱純化的最佳條件為：洗脫液含乙醇量60%，洗脫體積/柱體積比3倍，吸附時間4 h，加樣量/大孔樹脂投量比1∶20，體積流量7 mL/min。以上經提取及純化后的最終杜香黃酮得率是1.7 g/100g生藥，黃酮純度達88.0%。

杜香黃酮的抗炎模型實驗結果說明，杜香黃酮能夠明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，降低冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的提高，減少角叉菜膠致小鼠氣囊炎模型中氣囊灌洗液總蛋白含有量，降低血清NO，MDA水平，增強血清中SOD活性。提示杜香黃酮具有一定的抗炎活性，其作用可能與抑制NO炎癥因子生成，降低毛細血管通透性及增強清除氧自由基能力有關。杜香黃酮作為杜香的一類次生代謝產物，通過本實驗為進一步開發杜香的藥用價值提供了理論參考，結合其已被開發利用的揮發油部分，加之我國豐富的蘊藏資源，提示其具有廣泛的應用前景。

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R284.2 R284.5

B

1001-1528（2012）08-1590-04

2011-10-28

趙 頔 （1987—），男，碩士研究生，研究方向：資源植物化學。E-mail：aquarius_zd@126.com*

瞿偉菁 （1952—2012），男，教授，研究方向：資源植物化學。