CDH1和MLH1蛋白在甲狀腺癌中的表達及臨床意義

哈力木拉提·木爾扎提 賽力克·馬高維亞 華天書 楊曦阿不來提·買買提艾力 夏米西努爾·伊力克

1. 新疆醫科大學第一附屬醫院甲狀腺血管外科，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫科大學基礎醫學院生物教研室，新疆 烏魯木齊 830011；3. 蘭州軍區烏魯木齊總醫院臨床醫學研究所，新疆烏魯木齊 830000

CDH1和MLH1蛋白在甲狀腺癌中的表達及臨床意義

哈力木拉提·木爾扎提1賽力克·馬高維亞1華天書2楊曦3阿不來提·買買提艾力2夏米西努爾·伊力克2

1. 新疆醫科大學第一附屬醫院甲狀腺血管外科，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫科大學基礎醫學院生物教研室，新疆 烏魯木齊 830011；3. 蘭州軍區烏魯木齊總醫院臨床醫學研究所，新疆烏魯木齊 830000

背景與目的：上皮型鈣黏著蛋白1(cadherin 1，CDH1)和Mut L同源基因1(mut L homolog 1，MLH1)在不同腫瘤的發生、發展中起一定作用。本文旨在探討CDH1和MLH1在甲狀腺癌組織中的表達及臨床意義。方法：用免疫組織化學SP法檢測甲狀腺癌(65例)、甲狀腺腺瘤(24例)、橋本甲狀腺炎(15例)、結節性甲狀腺腫(7例)和癌旁正常組織(12例)中CDH1蛋白的表達，以及甲狀腺癌(56例)、甲狀腺腺瘤(17例)、橋本氏甲狀腺炎(13例)、結節性甲狀腺腫(8例)和癌旁正常組織(12例)中MLH1蛋白的表達，結合臨床病理因素進行分析。結果：CDH1蛋白在癌旁正常組織(83.33%)、結節性甲狀腺腫(100%)、橋本甲狀腺炎(93.33%)、甲狀腺腺瘤(79.17%)及甲狀腺癌(47.69%)中表達水平基本呈降低趨勢。MLH1蛋白在癌旁正常組織(83.33%)、結節性甲狀腺腫(75%)、橋本氏甲狀腺炎(76.92%)、甲狀腺腺瘤(52.94%)及甲狀腺癌(42.86%)中的表達水平呈降低趨勢。CDH1和MLH1蛋白表達水平在甲狀腺病變中表達差異均有統計學意義(P＜0.05)。隨著甲狀腺病變惡性程度升高呈降低趨勢，同時CDH1蛋白表達水平降低與PTC和FTC的臨床分期、淋巴結轉移密切相關。在甲狀腺癌中，CDH1和MLH1蛋白表達水平呈正相關(P＜0.05)。結論：CDH1、MLH1蛋白低表達可能與甲狀腺癌發生、轉移有關；在甲狀腺癌中，CDH1與MLH1蛋白表達之間有一定的相關性。

甲狀腺癌；CDH1；MLH1；免疫組化

甲狀腺癌占人類內分泌腺惡性腫瘤的90%以上［1］。據國際癌癥組織估計，2010年全世界新增甲狀腺癌病例大約為44 670例，大約死亡為1 690例［2］。在全球，每年診斷的分化型甲狀腺癌為122 800例，絕大多數發生在青壯年，每年約增長4%［3］。對新疆地區臨床病理資料的分析表明，甲狀腺癌的檢出率快速攀升［4-5］。雖然診斷甲狀腺癌的方法有多種，目前良、惡性甲狀腺腫瘤病理鑒別主要基于鏡下形態特征，但是有些惡性腫瘤的診斷指征有假相，致使鑒別很困難［6］，因此需要一些輔助手段來確定良、惡性。基于以上原因，惡性腫瘤的分子生物學研究成為建立腫瘤分子診斷和療效評估體系的重要切入點［7］。本研究用免疫組化SP法，測定上皮型鈣黏著蛋白1 (cadherin 1，CDH1)和Mut L同源基因1(mut L homolog 1，MLH1)蛋白在新疆地區甲狀腺病變患者組織中的表達及相關性，探討這些指標在甲狀腺癌發生、發展中的作用，為早期診斷提供新依據。

1 材料和方法

1.1 標本來源

本研究選用了新疆醫科大學第一附屬醫院病理科2004年1月—2009年2月歸檔的，經外科手術切除的甲狀腺疾病組織蠟塊標本共134例。年齡13~ 75歲，平均(44.89±26.06)歲，其中漢族77例、維吾爾族37例、哈薩克族11例、回族7例和蒙古族2例。所有的標本經病理確診為甲狀腺癌65例，甲狀腺腺瘤 24例，橋本甲狀腺炎15例和結節性甲狀腺腫7例。另外，取尸檢后經病理證實為正常甲狀腺組織12例作為對照。納入標準：①標本均經臨床和組織病理診斷證實，臨床病歷及病理資料完整；②術前無甲狀腺手術史及放療、化療史；③均無其他部位腫瘤病史。

1.2 主要試劑

CDH1抗體為鼠源性單克隆抗體濃縮液(H00000999-M01)，購自Abnova公司；MLH1抗體為鼠源性單克隆抗體濃縮液(ab14206)，購自Abcam公司。鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒及DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。聚賴氨酸處理過的載玻片及濕盒，均購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

所有標本經4%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續3 μm切片。SP染色按試劑盒說明操作，DAB顯色，光鏡下觀察。用已知甲狀腺正常組織標本作為陽性對照。

1.4 結果判斷標準

將制備好的切片置光學顯微鏡下觀察，陽性染色為細胞質、細胞核或細胞膜著色，呈棕黃色至深棕色。參照文獻［8］的方法，定性分析采用光鏡下每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，以著色細胞數和染色程度綜合判斷，最終結果采用雙盲法由兩名病理科醫師分別觀察所獲得的一致意見。陽性細胞百分率：0%～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。顯色強度：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分率和顯色強度的兩項得分相乘為每一視野的得分，最終取5個視野得分的平均值作為該標本的評分。按照分數將表達程度分為4個等級，即0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9分以上為強陽性(+++)。

按照歐洲癌癥研究和治療組織制定的評分法(EORTC法)［9］進行分類。根據性別分類，男性12例，女性0例；按組織學類型分類，乳頭狀腺癌0例，濾泡癌或髓樣癌10例，未分化癌或低分化癌45例；局部浸潤10，遠處轉移1處為15例，多處累加。由此累加所算出的預后指數≥66的甲狀腺癌為預后不良組，<66的為預后良好組。

1.5 統計學處理

所有數據應用SPSS 17.0統計軟件包分析。等級資料采用秩和檢驗，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗，P<0.05為差異有統計學意義；采用Spearman等級相關性分析，r值< 0.4為低度相關，0.4～0.7為中度相關，>0.7為高度相關。

2 結 果

2.1 CDH1在甲狀腺不同病變組織中的表達

免疫組化染色可見CDH1在甲狀腺不同病變組織中的陽性表達主要定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色(圖1)。

如表1所示，CDH1在不同的甲狀腺疾病組織中的表達水平有統計學意義(P<0.05)；CDH1蛋白的表達水平隨著甲狀腺病變惡性程度升高呈降低趨勢。正常組織表達率為83.33%，結節性甲狀腺腫為100%，橋本氏甲狀腺炎為93.33%，甲狀腺腺瘤為79.17%，甲狀腺癌為47.69%。

如表2所示，在甲狀腺癌組織中，CDH1蛋白在各臨床分期組及淋巴結轉移與否組中的表達差異均有統計學意義(P<0.05)，在組織學類型組、預后指數組、性別組、年齡組及民族組的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。

表 1 CDH1在不同甲狀腺病變組織中的表達Tab. 1 The expression of CDH1 in different thyroid lesion tissues(n)

表 2 CDH1在甲狀腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系Tab. 2 Relationships between expression of CDH1 and clinopathological variables in thyroid cancer tissues(n)

2.2 MLH1在甲狀腺不同病變組織中的表達

免疫組化染色可見MLH1在甲狀腺不同病變組織中的陽性表達定位于細胞核，少量定位于細胞質，呈棕黃色顆粒(圖2)。

如表3所示，MLH1在甲狀腺不同病變組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05)，在甲狀腺癌與正常組織中的表達差異有顯著統計學意義(P<0.01)；MLH1蛋白的表達水平也隨甲狀腺病變惡性程度升高呈降低趨勢，正常組織為83.33%，橋本氏甲狀腺炎為76.92%，甲狀腺腺瘤為52.94%，甲狀腺癌為42.86%。

表 3 MLH1在不同甲狀腺病變組織中的蛋白表達Tab. 3 The expression of MLH1 in different thyroid lesion tissues

如表4所示，甲狀腺癌組織中，MLH1蛋白在組織學類型組、臨床分期組、淋巴結轉移與否組、預后指數組、性別組、年齡組及民族組的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 CDH1與MLH1蛋白在甲狀腺癌中表達的相關性

如表5所示，在甲狀腺癌中CDH1與MLH1蛋白表達均呈低度的正相關(r<0.4，P<0.05)。

表 4 MLH1在甲狀腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系Tab. 4 Relationships between expression of CDH1 and clinopathological variables in thyroid cancer tissues

表 5 CDH1與MLH1在甲狀腺癌中表達的相關性分析Tab. 5 Correlation analysis of CDH1 and MLH1 expression in thyroid cancer

3 討 論

CDH1是一種抑癌基因，定位于人的16號染色體長臂(16q22.1)上，其編碼的蛋白被稱為E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)。E-cadherin是一種分子量為124×103單次穿膜的鈣依賴性糖蛋白，能以同種分子間“拉鏈式”結合的形式介導細胞間的黏附。研究證實在絕大多數惡性腫瘤中如乳腺癌、腸癌、結直腸癌都存在有上皮與間質轉變，造成E-cadherin表達下調或不表達，其介導細胞-細胞黏附功能削弱或喪失［10］，這使得腫瘤細胞容易脫離原發病灶，且易于進入周圍組織和血管，為腫瘤細胞的遠處轉移提供了必要條件。

本研究發現，CDH1蛋白表達在甲狀腺癌組織中明顯降低，提示甲狀腺上皮細胞表面的CDH1蛋白(E-cadherin)缺失或功能不正常，可能與甲狀腺腫瘤的發生、發展有關。Lee等［11］發現CDH1的失活都與其啟動子區的甲基化修飾有關。CDH1是一種腫瘤浸潤抑制基因，其編碼的E-cadherin表達與腫瘤的浸潤、轉移呈負相關。在多數腫瘤組織中顯示低表達或表達缺失，造成其表達降低的主要原因之一是CDH1基因啟動子區甲基化，這在胃癌、乳腺癌、宮頸癌及肝細胞癌中已被證實［12-13］。本研究認為CDH1在甲狀腺癌組織中的低表達可能與該基因的甲基化有關，需要進一步研究。在甲狀腺癌中，CDH1蛋白在淋巴結轉移組表達陽性率低于無淋巴結轉移組，表達差異有統計學意義(P<0.05)，提示CDH1蛋白表達下降與甲狀腺癌細胞向周圍侵襲有關。

甲狀腺癌臨床分期中CDH1蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅰ~Ⅳ期CDH1蛋白表達水平呈降低趨勢。不同甲狀腺癌組織中CDH1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，提示甲狀腺癌上皮細胞中CDH1蛋白低表達在甲狀腺癌組織學類型中無差別，這與Naito等［14］報道的結果一致。CDH1蛋白在不同性別、年齡及民族組中表達差異均無統計學意義(P>0.05)。甲狀腺正常組織和結節性甲狀腺腫中CDH1的蛋白表達多位于細胞膜且相對均勻穩定，甲狀腺腺瘤中CDH1的蛋白表達在細胞膜及近細胞膜處的胞質，呈彌散性，而在甲狀腺癌組織中出現了僅細胞質表達的現象。推測隨著腫瘤的發生、發展，CDH1蛋白表達不但減少，而且部位也發生了變化，從正常的細胞膜逐漸彌散至細胞質，從而影響其正常的黏附能力，無法抑制腫瘤浸潤與轉移。

MLH1基因是錯配修復系統中的重要成員，位于染色體3p21.3-23，基因組DNA全長約58 kb(不含動子)，含有19個外顯子，cDNA有2 268 bp的開放閱讀框架，編碼含756個氨基酸殘基的蛋白［15］。目前研究已經證實，MLH1基因在DNA修復方面發揮著重要作用，具體機制是MLH1蛋白與hPMS2蛋白形成異二聚體hMutLα識別并結合hMutSα(hMSH2-hMSH6復合物)和hMutSβ(hMSH2-hMSH3復合物)兩種異源二聚體，參與錯配堿基的修復過程［16］。已有研究表明，MLH1基因低表達是結腸癌、肺癌等惡性腫瘤發病的重要影響因素。Oh等［17］提出MLH1蛋白表達障礙是導致結腸癌的主要原因。Erdamar等［18］采用組織芯片和免疫組化方法比較研究MLH1和MSH2基因指出，這兩個蛋白表達缺失與結腸癌發生有關。MLH1基因的高表達在一定程度上會抑制DNA突變或損傷時造成的細胞惡變，進而抑制惡性腫瘤的發生發展，反之其低表達或缺失則起促進作用。

MLH1基因的高表達在一定程度上會抑制DNA突變或損傷時造成的細胞惡變，進而抑制惡性腫瘤的發生、發展，反之其低表達或缺失則起促進作用。

本研究發現，甲狀腺癌組的MLH1蛋白表達陽性率明顯低于正常組織組、橋本甲狀腺炎組和甲狀腺腺瘤組，其表達差異均有統計學意義(P<0.05)，表明MLH1基因表達降低可能導致錯配修復系統功能減弱，使DNA復制過程中出現的錯配堿基得不到及時的糾正，突變累積，致使腫瘤發生，這是一部分甲狀腺癌發生的原因，另一個原因可能是該基因的甲基化導致的。Xue等［19］發現MLH1的失活都與其啟動子區的甲基化修飾有關。MLH1基因啟動子區CpG島的過度甲基化是導致基因失活、腫瘤發生的一種機制，在遺傳性非息肉病性結直腸癌和子宮內膜癌中已被證實［20-21］。MLH1蛋白在甲狀腺癌細胞中陽性反應顆粒主要出現在細胞質，而在正常組織、結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎中則主要出現在細胞核。細胞質內的MLH1蛋白不能參與錯配修復，因為DNA復制、轉錄的場所是細胞核。甲狀腺癌細胞MLH1蛋白主要在細胞質中表達，說明蛋白合成后可能出現由細胞質向細胞核轉運的障礙，導致該蛋白不能到達發揮功能的場所，細胞發生異常，增加了甲狀腺癌發生的概率。甲狀腺癌組的MLH1蛋白在性別組、年齡組、民族組、組織學類型組、臨床分期組、淋巴結轉移與否組及預后指數組的表達差異均無統計學意義(P>0.05)，提示MLH1蛋白僅與腫瘤的發生有關，在腫瘤的惡性程度、病情變化及轉移過程中不發揮作用。

CDH1與MLH1蛋白在甲狀腺癌中都屬于低表達狀態，兩者的表達呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。MLH1是一種錯配修復基因，可能在其低表達時錯配修復的功能不再發揮，此時CDH1基因的錯配有可能未被及時修復，從而蛋白表達被抑制，提示CDH1與MLH1蛋白低表達與甲狀腺癌的發生、發展有關。

［1］REIS E M, OJOPI E P, ALBERTO F L, et al. Large-scale transcriptome analyses reveal new genetic marker candidates of head neck, and thyroid cancer ［J］. Cancer Res, 2005,65: 1693-1699.

［2］STEPHEN J K, CHITALE D, NARRA V, et al. DNA methylation in thyroid tumorigenesis ［J］. Cancers (Basel),2011, 3(2): 1732-1743.

［3］QuickFACTS Thyroid Cancer. American Cancer Society［N］; Atlanta: 2009, 1-131.

［4］夏米西努爾·伊力克, 熱莎來提·吐爾遜, 阿布力孜·阿不都拉. 新疆人群中199例甲狀腺癌臨床病理分析 ［J］.現代腫瘤學, 2008, 16(6): 937-939.

［5］夏米西努爾·伊力克, 尼加提·熱合木, 阿布力孜·阿布杜拉, 等. 116例維、漢甲狀腺疾病臨床病理分析 ［J］.新疆醫科大學學報, 2009, 32(6): 709-713.

［6］PRASAD N B, SOMERVELL H, TUFANO R P, et al.Identification of genes differentially expressed in benign versus malignant thyroid tumor ［J］. Clin Cancer Res, 2008,14(11): 3327-3337.

［7］余紅梅, 陳世清, 朱大菊, 等. 甲狀腺腫瘤相關基因的研究進展 ［J］. 臨床外科雜志, 2006, 14(9): 597-599.

［8］王恩華. 病理學 ［M］. 北京: 高等教育出版社. 2003:287-288.

［9］周庚寅, 等. 甲狀腺病理與臨床 ［M］. 北京: 人民衛生出版社, 2005: 135.

［10］黃菊, 程夏楷, 楊彬, 等. E-鈣黏蛋白復合體及其對腫瘤細胞的作用 ［J］. 生命的化學, 2005, 25(3): 247-250.

［11］LEE S, HWANG K S, LEE H J, et al. Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in colorectal neoplasia［J］. Lab Invest, 2004, 84(7): 884-893.

［12］WANG L, ZHANG F, WU P P, et al. Disordered beta-catenin expression and E-cadherin/CDH1 promoter methylation in gastric carcinoma ［J］.World J Gastroenterol, 2006, 12 (26):4228-4231.

［13］徐軍, 王紅琳, 陸果川, 等. 人宮頸癌組織CDH1和PAX1基因甲基化研究［J］. 腫瘤, 2009, 29 (5): 483-485.

［14］NAITO A, IEASE H, KUZUSHIMA T, et al. Clinical significance of E-cadherin expression in thyroid neopasms［J］. Surg Oncol, 2001, 76(3): 176-180.

［15］DUNLOP M G, FARRINGTON S M, CAROTHERS A D, et al. Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations［J］.Hum Mol Genet, 1997, 6(1): 105-110.

［16］何云, 莊志雄. DNA錯配修復的分子機制 ［J］. 衛生毒理學雜志, 2001, 15(4): 246-249.

［17］OH K, REDSTON M, ODZE R D. Support for hMLH1 and MGMT silencing as a mechanism of tumorigenesis in the hyperplastic-adenoma-carcinoma (serrated) carcinogenic pathway in the colon ［J］. Hum Pathol, 2005, 36(1): 101-111.

［18］ERDAMAR S, UCARYILMAZ E, DEMIR G. Importance of MutL homologue MLH1 and MutS homologue MSH2 expression in Turkish patients with sporadic colorectal cancer［J］. World J Gastroenterol, 2007, 13(33): 4437-4444.

［19］XUE W C, CHAN K Y, FENG H C, et al. Promoter hypermethylation of multiple genes in hydatidiform mole and choriocarcinoma ［J］. Mol Diagn, 2004, 6(4): 326-334.

［20］吉敏, 盛劍秋, 付蕾, 等. 遺傳性非息肉病性結直腸癌錯配修復基因MLH1啟動子甲基化研究 ［J］. 胃腸病學和肝病學雜志, 2008, 17(4): 291-293.

［21］舒珊榮, 柯佩琪, 李小毛, 等. 子宮內膜癌錯配修復基因hMLH1的表達和啟動子甲基化研究 ［J］. 中山大學學報(醫學科學版), 2009, 30(3): 241-245.

Expression and clinicopathological significances of CDH1 and MLH1 protein in thyroid carcinoma

HALIMULATI·Muerzhati, SAILIKE·Magaoweiya, HUA Tian-shu, YANG Xi, WU Shuang, LIU Xiaoran, ABULAITI·Maimaitieli, XIAMIXINUER·Yilike(Department of Thyroid Vascular Surgery,The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang 830011,China)

XIAMIXINUER·Yilike E-mail：shamshinur@yahoo.com.cn

Background and purpose：It was reported that abnormal expression of cadherin 1 (CDH1)and mut L homolog 1 (MLH1) is often associated with tumor genesis and progression. The study investigated the expression of CDH1 and MLH1, as well as their clinicopathological significance in thyroid cancer.Methods：Immunohistochemical SP method was used to determine the expression of CDH1 in 65 thyroid cancer tissues, 24 thyroid adenoma, 15 Hashimoto’s thyroiditis, 7 nodular goiter and 12 peri-tumor tissues, and MLH1 in 56 thyroid cancer tissues, 17 thyroid adenoma, 13 Hashimoto’s thyroiditis, 8 nodular goiter and 12 peri-tumor tissues.Results：Expression of CDH1 and MLH1 both decreased from normal tissue (83.33% and 83.33%), nodular goiter (100% and 75%), Hashimoto’s thyroiditis (93.33% and 76.92%), thyroid adenoma (79.17% and 52.94%) to thyroid cancer (47.69%and 42.86%) differently. There were statistic differences in expressions of CDH1 and MLH1 between the different thyroid pathological tissues (P＜0.05). Expression level of CDH1 and MLH1 decreased with the malignancy of thyroid cancer. Decreasing of expression of CDH1 correlated with PTC and FTC, also with lymph node metastasis. There was positive correlation between the CDH1 and MLH1 expressions in thyroid cancer (r＜0.4,P＜0.05).Conclusion：Low expression of CDH1 and MLH1 might be related to the thyroid cancer and its metastasis; there is positive correlation between the CDH1 and MLH1 in thyroid cancer.

Thyroid cancer; CDH1; MLH1; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.002

R736.1

A

1007-3639(2012)05-0329-07

國家自然科學基金(No：30860275)；自治區地方性疾病分子生物學實驗室開放性課題項目(No：XJDX0208-2005-3)。

夏米西努爾·伊力克 E-mail:shamshinur@yahoo.com.cn

2011-12-10

2012-03-21）