MicroRNA-338-3p在結直腸癌中的表達及其臨床意義

蘇桂源 鄧海軍 孫凱 余江 李國新

南方醫科大學南方醫院普通外科，廣東 廣州 510515

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化道常見惡性腫瘤，近年來發病率和死亡率明顯上升，隨著分子生物學技術的發展，已經明確結直腸癌的發生、發展是一個多步驟、多基因參與的過程，而抑癌基因的失活在癌的發生中具有重要作用，研究新的抑癌基因對結直腸癌的診斷治療及預后有重要意義。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)對生物體生長發育和分化調控起著重要作用，其表達失衡可促進多種腫瘤的發生、發展［1-2］。miRNA-338-3p(miR-338-3p)是新發現的miRNA，可通過調控腫瘤細胞侵襲、轉移等惡性生物學行為參與腫瘤的演進過程，但其在結直腸癌中的表達狀況及其調控靶目標鮮見研究報道［3］。本實驗旨在觀察結直腸癌與毗鄰癌旁組織中miR-338-3p差異表達狀況，并分析其表達水平與臨床病理特征之間的關系及對預后判斷的價值，探討miR-338-3p在結直腸癌發生、發展中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

40例結直腸癌及對照癌旁組織標本取自南方醫院2008年9—11月間手術患者，均經術后病理學檢查證實。其中男性21例，女性19例；年齡(55.8±11.2)歲；結腸癌24例，直腸癌16例。完善相關病理資料，包括腫瘤細胞分化程度、浸潤層次、TNM分期(NCCN 2009版)、CEA水平等。癌旁組織取自距離癌腫5 cm的腸黏膜，另切取距離癌腫10 cm以上腸黏膜作為正常對照?；颊咝g前均未接受放化療。標本采集后快速放至液氮中冷凍，-80 ℃保存。

1.2 隨訪資料

隨訪時間自術后第1天至末次隨訪或死亡時間，以月為計算單位，隨訪至2011年11月截止，隨訪時間最長36個月，最短4個月，死亡11例，隨訪方式為門診復查、信件及電話隨訪。

1.3 試劑與儀器

TRIzol試劑購自Invitrogen公司，Allin-One? miRNA qRT-PCR檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司，DU800核酸蛋白分析儀購自美國Beckman Coulter公司，PCR儀采用ABI Prism?7500。

1.4 引物設計與合成

由miRBase數據庫(http://microrna.sanger.ac.uk/)和GenBank查找基因序列，使用Primer-Express 2.0軟件進行引物設計，miR-338-3p及內參照RNU6B由GeneCopoeia公司設計合成。

1.5 Real-time RT-PCR檢測標本中miR-338-3p表達

常規TRIzol試劑抽提總RNA，DEPC水溶解沉淀，應用DU800核酸蛋白分析儀測定RNA濃度，根據RNA在A260nm/A280nm≥1.8及甲醛變性凝膠電泳28 S、18 S的RNA條帶亮度比值≥1.5鑒定RNA純度及完整性。miRNA逆轉錄反應：往冰上預冷的RNase free反應管內加入以下試劑至總體積25 μL：終濃度為2.0 μg的總RNA 2.0 μL、2.5 U/μL PolyA聚合酶 1.0 μL、逆轉錄酶RTase Mix 1.0 μL、5×Reaction Buffer 5.0 μL、去RNase無菌蒸餾水16 μL；混勻配制的反應液，短暫離心后在37 ℃反應60 min，結束后再進行85 ℃ 5 min滅活處理，所得逆轉錄產物用滅菌水稀釋5倍進行下游qPCR實驗。構建miR-338-3p和RNU6B的Real-time Q-PCR反應體系：cDNA 2.0 μL、2×All-in-ONE Q-PCR Mix 10 μL、通用PCR引物2.0 μL、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、無菌蒸餾水3.6 μL、miR-338-3p或RNU6B引物2.0 μL；qPCR反應采用標準的三步法進行：95 ℃預熱10 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸34 s，共40個循環；循環結束后立即進行熔解曲線分析66 ℃～95 ℃、升溫速率為每次0.5 ℃、恒溫時間每次6 s，每個標本均作復管PCR反應，并重復3次。

1.6 PCR產物的定量校正和判定標準

以RNU6B作為內參照，用RNU6B的拷貝數作為校正基數，通過Light Cycler軟件直接獲得各樣本中miR-338-3p的Ct(cycle threshold)值，與同樣本中RNU6B的Ct值相減，即獲得該樣本中miR-338-3p的ΔCt值；由于以Real-time Q-PCR來檢測RNA時，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉錄效率的限制，我們再以正常腸黏膜的ΔCt值作為校正，得出-ΔΔCT值，ΔΔCT=(CTmiR-338-3p-CTU6)目的樣本-(CTmiR-338-3p-CTU6)校正樣本，按目的基因表達量=2-ΔΔCT公式計算各樣本中miR-338-p的確切含量。

1.7 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，實驗所得數據以表示，組間比較采用配對設計兩兩比較t檢驗；腫瘤臨床病理參數與miR-338-3p表達水平之間的關系分析采用Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗；用Kaplan-Meier法分析生存期并繪制生存曲線，生存曲線的比較用log-rank檢驗進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR反應效果及特異性

40例樣本中miR-338-3p cDNA顯示呈指數增長，并擴增達到平臺期，Ct值處于15～35之間，其擴增曲線為一組典型的S型曲線(圖1)，擴增效率理想。通過設置復孔取平均值，即得到各樣本中目的基因擴增的Ct值作為miR-338-3p定量判定。PCR完成后于溶解程序中收集熒光信號，得到熔解曲線，miR-338-3p對應的Tm值為(77.43±0.14) ℃，熔解溫度均一，峰形單一銳利，證明反應特異性良好，無非特異擴增、引物二聚體及發夾結構的出現(圖2)。

2.2 miR-338-3p含量測定

與癌旁組織相比，miR-338-3p在結直腸癌組織中表達明顯下調(0.122 6±0.087 3vs0.905 8±0.410 5)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 miR-338-3p表達水平與結直腸癌臨床病理特征的關系

miR-338-3p表達水平與腫瘤TNM分期(P=0.031)、浸潤深度(P=0.001)以及分化程度(P=0.042)有關，而與性別、年齡、腫瘤部位、CEA水平無關(表1)。

表 1 miR-338-3p表達水平與結直腸癌臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between miR-338-3p expression and clinicopathological features in colorectal cancer patients

2.4 miR-338-3p表達水平與預后的關系

以結直腸癌患者的術后3年無進展生存期(progression-free survival，PFS)及總生存期(overall survival，OS)分別繪制生存曲線，取樣本中miR-338-3p表達水平的平均值0.122 6閾值，將40例樣本分為高表達組與低表達組，結果miR-338-3p低表達組與高表達組的PFS差異有統計學意義(P=0.039)，低表達組的手術預后效果顯著低于高表達組(圖3)；而miR-338-3p低表達組與高表達組的OS差異無統計學意義(P=0.214，圖4)。

3 討 論

結直腸癌的發生是多因素、多步驟的發展過程，同樣也是多基因發生異常變化的過程，隨著研究的發展，越來越多的分子生物學標志表達變化被確認與結直腸癌的發生有關，并具有相應的臨床價值［4］。miRNA是存在于生物體內的一類長度約為19～22個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與基因轉錄后水平的調控，既往研究證實miRNA對生命體的生長發育、增殖分化等基本生物學行為起著關鍵的調控作用，而其失衡表達亦可促進多種人類疾病尤其是腫瘤的發生、發展，miRNA與腫瘤調控關系逐漸成為研究熱點［5-6］。

miR-338-3p是新發現的一種miRNA，其在多種惡性腫瘤中表達下調。國內學者曾應用液相芯片篩選肝細胞癌與毗鄰癌旁組織中差異表達miRNA，發現miR-338-3p在肝細胞癌中表達顯著下調；進一步應用Hierarchical Cluster軟件以miR-338-3p為標準配對標本進行聚類分析時，可將肝細胞癌與毗鄰癌旁組織明顯分開［7］。本研究結果亦證實，miR-338-3p在結直腸癌中表達水平較癌旁組織顯著下降，提示miR-338-3p下調可能作為“抑癌基因”的表達缺失而參與了腫瘤始發及演進，但其具體發揮何種抑癌生物學作用尚不清楚。miR-338-3p定位于染色體17q25.3，而染色體17q23-25位點常是多種惡性腫瘤的突變“熱點”，且其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠處轉移等惡性生物學行為密切相關，此現象亦提示了miR-338-3p可能參與了腫瘤侵襲轉移的惡性進程，亦與我們前期預實驗中所發現的miR-338-3p在轉移性結直腸癌中表達水平更行下降的狀況相一致，說明miR-338-3p可能是一種與結直腸癌侵襲轉移密切相關的“抑癌基因”。

結直腸癌的臨床病理特征是判斷腫瘤惡性程度及預后的主要依據［8］，本研究結果表明，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的結直腸癌組織中miR-338-3p表達水平顯著低于Ⅰ+Ⅱ期結直腸癌組織；癌組織的局部浸潤達到T4期的miR-338-3p表達水平顯著低于T1～T3期；分化程度低的結直腸癌組織miR-338-3p表達水平顯著低于高、中分化的結直腸癌組織。因此miR-338-3p的低表達不僅與結直腸癌的發生有關，并且與腫瘤的侵襲、浸潤及分化程度相關。

既往研究發現，結直腸癌患者術后30%～50%會出現復發或者轉移，且復發者80%～90%發生在術后2～3年內［9-11］。本研究的3年隨訪資料顯示，在PFS的比較中miR-338-3p低表達組的生存時間顯著低于高表達組，雖然OS兩組之間差異無統計學意義，但低表達組的生存率(65.2%)低于高表達組(82.4%)，提示miR-338-3p表達水平越低，其術后復發轉移的可能性越大，臨床預后越差。

綜上所述，miR-338-3p與結直腸癌的發生發展有關，可能也是結直腸癌的一個抑制侵襲轉移因子，其低表達水平與腫瘤的TNM分期、浸潤深度以及分化程度密切相關，并可作為結直腸癌預后判斷的新的生物標志物。

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