Rock2對紫外線誘導肝癌細胞DNA損傷的保護作用及調節機制

李國惠 劉天德 余新 劉秀霞 袁榮發 蔣成行 邵江華,

1.南昌大學第二附屬醫院肝膽外科，江西 南昌330006；

2.江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006；

3.金華市中心醫院肝膽外科，浙江 金華 321000

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，居全球腫瘤發病率的第五位，主要高發于東南亞、撒哈拉以南的地區和歐洲南部，其發病率和死亡率均呈逐年上升的趨勢［1］。在我國，年發病率高達35～50/10萬，增長速度非常快，已升至消化道腫瘤的第二位，嚴重威脅著人民的生命健康。盡管近年來HCC診斷、治療技術不斷進步，但預后仍然較差。如何阻斷慢性肝臟疾病向HCC的惡性轉化，并在疾病尚處于早期階段及時采取有效措施進行防治已成為能否進一步提高HCC療效的關鍵。HCC的發生是一個多基因參與的多階段、多步驟過程，涉及肝細胞損傷修復、腫瘤基因和抑癌基因作用的復雜過程。

Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase ,Rock)是Rho/Rock信號轉導通路的關鍵信號分子，包括Rock1和Rock2兩種亞單位，兩者有65%完全一致，90%的激酶區域存在同一性［2］。Rock1和Rock2是分子量約1.6×105的絲、蘇氨酸激酶，參與調節細胞的多種行為和功能，并與腫瘤惡性程度、腫瘤發生、轉移、細胞的黏附、收縮、遷移和胞漿的分裂有關。研究發現，在許多不同的腫瘤組織中均觀察到Rock2基因表達的增高［3］。本研究通過紫外線(ultraviolet，UV)誘導肝癌細胞DNA損傷，觀察Rock2對肝癌細胞的保護作用，為提高HCC預后提供新的治療靶向基因。

1 材料和方法

1.1 材料

主要試劑：DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，總RNA抽提試劑TRIzol和脂質體LipfectamineTM2000(Invitrogen公司)，一步法反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR Green熒光定量PCR Mix(Qiagen公司)，shRock2(Santa Cruz公司)，羊抗多克隆Rock2一抗(Santa Cruz，sc-1851)，兔抗多克隆Cdc25A一抗(Santa Cruz，sc-97)。Cdk2/Cyclin E活性熒光共振能量轉移法定量檢測試劑盒購自美國GENMED公司。Rock2引物：Sense：5’-ATTCAGCAGCTGGAATCTAA-3’和Antisense：5’-GTCTCTTCTCCAGTTCTAC-3’，長度為238 bp，購自上海生工生物工程有限公司。人肝細胞性肝癌細胞株Huh-7和HepG2由本實驗室保存。

1.2 細胞株的培養及轉染

將Huh-7和HepG2細胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、CO2體積分數為5%的環境中培養。按脂質體LipfectamineTM2000轉染試劑說明進行轉染，分不同時段檢測細胞生長情況。

1.3 shRNA轉染后實時熒光定量PCR對Rock2 mRNA的檢測

轉染shRock2的肝癌細胞48 h后，抽提總RNA經純度分析后，逆轉錄為cDNA，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。測定cDNA濃度，稀釋為統一的200 ng/μL。同時設立空白對照組、干擾無意義組及轉染PBS組。采用SYBR Green法，在ABI PRISM 7500自動熒光PCR儀上進行。反應條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min。依據標準曲線計算目的基因Rock2和GAPDH的mRNA量，每個樣品Rock2與GAPDH基因濃度比值，即為校正后的相對含量。實驗重復3次。

1.4 shRock2轉染后對Rock2蛋白的檢測

干擾Rock2表達48 h后，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量50 μg 蛋白質樣品加入上樣緩沖液煮沸5 min 后行10% SDS-PAGE電泳、濕轉，然后分別結合對應一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗，應用ECL 發光試劑顯示蛋白質條帶，暗室曝光。每組實驗共平行進行3次。

1.5 UV誘導DNA損傷

洗凈培養皿中的培養基，利用Stratalinker 2400紫外交聯儀，254 nm波長進行細胞照射，劑量為100 J/m2。培養2 h進行檢測或繼續培養。

1.6 MTT比色法檢測各組細胞的增殖

1.7 蛋白質印跡法(Western blot)檢測Cdc25A的表達

細胞接種6孔板，干擾Rock2 48 h后，行UV照射100 J/m2，繼續培養2 h。提取總蛋白，進行Western blot檢測。

1.8 Cdk2/Cyclin E活性的檢測

將Huh-7和HepG2細胞按每孔8×103接種于96孔培養板，每孔加液量200 μL，干擾Rock2 48 h后，行UV照射100 J/m2，Cdk2/Cyclin E活性檢測按照熒光共振能量轉移法定量檢測試劑盒說明書進行。

1.9 統計學處理

數據統計采用SPSS 15.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 shRock2轉染后Rock2 mRNA的表達情況

將shRock2轉染到肝癌細胞Huh-7和HepG2中，沉默Rock2表達48 h后，熒光定量PCR檢測發現，Rock2 mRNA的表達較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而正常組、干擾無意義組及PBS組間差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

2.2 shRock2轉染后Rock2 蛋白的表達情況

將shRock2轉染到肝癌細胞Huh-7和HepG2中，沉默Rock2表達48 h后，Western blot檢測結果顯示，Rock2 蛋白的表達較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而正常組、干擾無意義組及PBS組間差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。

2.3 UV誘導DNA損傷時肝癌細胞增殖的變化

利用UV照射肝癌細胞后，發現肝癌細胞增殖受到抑制，而且Rock2低表達組肝癌細胞的增殖抑制更為明顯。這表明UV造成DNA損傷時，Rock2對肝癌細胞的生存起保護作用(圖3)。

2.4 UV誘導DNA損傷時對Rock2及Cdc25A表達情況的影響

沉默Rock2基因48 h后，利用UV 100 J/m2照射細胞，然后繼續培養2 h，提取總蛋白Western blot檢測Cdc25A表達情況。結果顯示，DNA損傷時抑制Rock2表達可導致肝癌細胞中Cdc25A表達進一步下降(圖4)。

2.5 Cdk2/Cyclin E活性與Cdc25A表達的關系

Cdk2/Cyclin E是Cdc25A調控DNA復制起始最重要的調控因子，結果顯示，UV誘導DNA損傷后，Cdk2/Cyclin E活性隨Cdc25A表達的降低而下降(圖5)。

3 討 論

Rock是新近發現的Rho/Rock信號轉導通路的關鍵信號分子，研究報道的Rho /Rock通路可以作為腫瘤治療的靶點［4］。DNA損傷可引發多種細胞反應，包括DNA修復、細胞周期延遲或阻滯及細胞凋亡等，其中細胞周期延遲或阻滯是通過DNA損傷檢查點完成的。如果DNA損傷不能得到及時糾正，則會導致嚴重的后果，如癌變等［5-6］。Cdc25A是控制G1/S期調節途徑的重要檢查點蛋白，在轉導級聯激活作用中是一個重要的效應分子［7］。

本課題組成功對Rock2實施了基因沉默，證實將shRNA轉染入肝癌細胞Huh-7和HepG2后，誘導RNA干擾效應，可有效抑制Rock2在細胞內的表達。當UV誘導肝癌細胞DNA損傷時，干擾Rock2組較Rock2正常組肝癌細胞的增殖抑制更加顯著，表明Rock2對肝癌細胞的生存起保護作用。正常情況下，UV引起細胞DNA損傷時，Cdc25A表達降低，其下游作用檢查點Cdk2/Cyclin E活性也隨之下降。然而在UV引起細胞DNA損傷的情況下，抑制Rock2表達時，發現Cdc25A表達降低更為明顯，而且Cdk2/Cyclin E活性也隨之下降。

在人細胞中，Cdc25A過表達會引起Cdk2/Cyclin E依賴激酶的早期激活，導致細胞過早進入S期，細胞生長的失控，極可能引起惡性轉化［8］。相反，Cdc25A表達的降低可以導致Cdk2/Cyclin E活性的降低和Cdc45直接作用DNA復制起始的抑制［9］。當細胞中不能降低Cdc25A表達時會表現出檢查點阻滯功能的障礙，包括抗輻射的DNA合成及Cdk2活性的升高。表明Rock2可能是通過調節Cdc25A的表達及Cdk2/Cyclin E活性而對肝癌細胞的生存起保護作用。

目前，本課題組正在深入尋找肝癌細胞中Rock2如何作用于Cdc25A的調節機制及上游的作用激酶。通過進一步研究，將闡述Rock2在HCC形成過程中的蛋白作用通路，Rock2有望成為HCC的診斷、治療以及術后檢測的靶基因。

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