小細胞肺癌組織微環境中VEGF與DC成熟及Treg關系的探討

張家麗 任秀寶

天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市腫瘤研究所免疫實驗室，

天津醫科大學附屬腫瘤醫院生物治療科，天津 300060

小細胞肺癌(small cell lung cancer)又稱小細胞未分化癌，是一種特殊類型的肺癌，約占全部肺癌的15%～20%［1］；具有惡性度高、進展快，傾向全身播散，預后差等特點。研究小細胞肺癌的發生、發展以及轉移機制，尋求新的治療方案，延長小細胞肺癌患者的生存期成為目前的研究熱點。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種多功能的細胞因子，對腫瘤血管的生成有較強誘導作用，在大多數腫瘤組織中高表達。有研究表明，VEGF對CD34+造血干細胞向樹突狀細胞(dentric cell，DC)的分化具有較強的抑制作用，不但可以抑制DC的成熟，還可以阻礙DC的抗原遞呈功能，抑制DC等抗原遞呈細胞的分化，進一步影響細胞毒性T細胞的擴增、活化及免疫殺傷作用，未成熟的DC可以誘導調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)的生成，負向調節機體的免疫監視功能，導致腫瘤的免疫逃逸［2-3］。本研究旨在探討小細胞肺癌中VEGF的表達及其與DC成熟的關系，并分析其與臨床資料的相關性，為小細胞肺癌的治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 標本

收集天津醫科大學附屬腫瘤醫院自2000年1月—2010年9月手術切除的13例小細胞肺癌患者術后癌組織標本及癌旁正常組織(癌組織邊緣外>2 cm的組織)標本，以及61例小細胞肺癌患者術后癌組織標本。所有患者術前未行任何抗癌治療，均有完整的臨床病歷資料。術后立即取材經4%甲醛液固定，常規石蠟包埋；術后病理診斷為小細胞肺癌。61例小細胞肺癌患者中男性47例，女性14例，男女比例為3.4∶1；中位年齡58歲。

1.2 主要試劑

一抗小鼠抗人CD1a單克隆抗體購于santa cruz公司，一抗兔抗人CD83多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，一抗小鼠抗人Foxp3單克隆抗體購自美國 eBioscience 公司，一抗兔抗人VEGF單克隆抗體、工作液及DAB均購于中杉金橋公司，二抗購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化檢測VEGF、CD1a、CD83、Foxp3的表達

將小細胞肺癌組織、癌旁正常組織的蠟塊按4 mm厚度切片，常規脫蠟水化。在pH為6.0的0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中高壓抗原修復，加一抗稀釋液(CD1a、CD83抗體稀釋度為1∶600；Foxp3抗體稀釋度為1∶200)，4 ℃濕盒溫育過夜，加入二抗，DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗做空白對照。

1.4 免疫組化結果的判定

VEGF定位于細胞質，將細胞質出現均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽性細胞。CD1a、CD83定位于細胞膜或細胞質，將細胞膜或細胞質出現均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽性細胞。Foxp3定位于細胞核，將細胞核內出現棕黃色顆粒定義為陽性細胞。VEGF的表達結果判斷參照文獻［4］：①陽性細胞評分：0分為無陽性細胞，1分為陽性細胞<25%，2分為陽性細胞26%～50%，3分為陽性細胞>50%；②染色強度評分：0分為陰性，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞百分率染色強度為總積分，0～2分為陰性，3～4分為弱陽性，5～6分為強陽性。CD1a、CD83的結果判定根據Furukawa等［5］提出的分級標準：隨機計數10個高倍視野(×400)，觀察計數DC，計算每個高倍視野的DC平均數。根據每個高倍視野中DC的數目進行分組：將沒有DC表達定為陰性組，有DC表達定為陽性組。Foxp3結果判定，選擇著色最深的10個代表區在高倍鏡(×40)下每區隨機計數100個細胞，共計1 000個細胞，計算陽性細胞陽性比例的平均值。

1.5 統計學處理

計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，癌與癌旁正常組織比較應用t檢驗進行統計分析，與臨床資料之間的分析采用χ2檢驗，通過計算Pearson系數來分析小細胞肺癌組織中不成熟DC表達與Foxp3陽性細胞比例的相關性。所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件分析處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF、CD1a、CD83、Foxp3在癌組織與癌旁正常組織的表達

VEGF主要是在小細胞肺癌腫瘤細胞的細胞質內出現棕黃色顆粒，并且在腫瘤壞死組織邊緣及腫瘤浸潤區表達較強，在血管內皮細胞也可有陽性表達(圖1A)，13例小細胞肺癌患者癌組織中的VEGF表達明顯高于癌旁正常組織(P=0.000)。

以CD1a、CD83為標志的DC呈棕褐色樹突狀散在分布于腫瘤組織中(圖1B、C)，13例小細胞肺癌患者中每高倍視野癌組織中CD1a+DC數量顯著高于癌旁正常組織(5.49±3.55vs1.94±0.86，P=0.007)，每高倍視野癌組織中CD83+DC數量顯著低于癌旁正常組織(0.72±0.77vs3.15±2.32，P=0.002) 。

Foxp3為細胞核表達呈棕黃色(圖1D)，13例小細胞肺癌患者每高倍視野癌組織中Foxp3+淋巴細胞比例顯著高于癌旁正常組織(5.88%±4.21%vs0.031%±0.075 %，P=0.005)。

2.2 VEGF、CD1a、CD83、Foxp3在癌組織中的表達

在61例小細胞肺癌癌組織中，VEGF表達陽性50例，陽性率81.97%；有51例檢測到CD1a+DC，陽性率為83.61%；有36例檢測到CD83+DC，陽性率為59.02%；有52例檢測到Foxp3+淋巴細胞，陽性率為85.25%。

2.3 VEGF與CD1a、CD83、Foxp3之間表達的相關性

CD1a+DC數量在VEGF陰性、陽性組之間差異無統計學意義(P>0.05) ，CD83+DC數量在VEGF陰性、陽性組之間差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.4 CD1a、CD83與Foxp3之間表達的相關性

在檢測到CD1a+DC的51例標本中，Foxp3的陽性率為86.27%，每高倍視野Foxp3+淋巴細胞比例顯著高于CD1a陰性組(6.34%±4.36%vs4.36%±2.29%，P<0.05)。CD1a+DC數量與Foxp3+T細胞陽性比例之間呈正相關(r=0.373，P=0.007，圖2)。

表 1 61例腫瘤浸潤DC、Foxp3+Treg與VEGF表達關系Tab.1 The relationship of DC, Foxp3+Treg and the expression of VEGF in 61 case

Foxp3在CD83+DC表達的陽性率為80.56%，在CD83陽性組中Foxp3+淋巴細胞每高倍視野陽性比例與CD83陰性組之間差異無統計學意義(5.42%±3.73%vs6.55%±4.82%，P>0.05)。CD83陽性DC數量與Foxp3+T細胞陽性比例之間無相關性(P>0.05)。

2.5 CD1a、CD83、Foxp3表達與患者臨床病理特征的關系

通過上述指標與患者各臨床病理特征進行相關性分析后發現，CD1a、Foxp3在患者不同年齡、吸煙史、腫瘤家族史、胸膜粘連、腫塊大小、腫瘤類型、臨床分期、淋巴結轉移情況之間差異均無統計學意義(P>0.05)，僅CD83+DC在小細胞肺癌患者不同腫塊大小之間差異有統計學意義(χ2=4.665，P=0.030)。

3 討 論

小細胞肺癌較其他類型肺癌診斷前的癥狀期短，確診后5年生存率僅為2%～10%，而10年生存率僅為1%～2%［6-7］，約2/3的患者就診時已有全身廣泛轉移。小細胞肺癌的腫瘤倍增時間僅33 d，且絕大多數為低分化癌。

人體免疫系統具有免疫監視功能，能識別和殺傷“非己”物質，使機體可以通過天然和獲得性免疫抵抗腫瘤。然而腫瘤在這種免疫監視下仍能發生、發展、轉移，表明腫瘤具有逃避機體免疫監視的功能。研究表明，在腫瘤微環境內參與腫瘤組織與自身免疫系統相互作用的因素主要包括：局部抗原遞呈細胞功能障礙、抑制性免疫調節細胞作用及免疫負調節性細胞因子作用等。DC作為機體內功能最強的抗原呈遞細胞，在抗腫瘤免疫中發揮著關鍵作用。在本實驗所檢測到的VEGF陽性表達的小細胞肺癌組織中，CD83的表達顯著低于VEGF陰性表達的組織，且VEGF表達陽性與強陽性組織中，CD83的表達也存在差異，提示VEGF影響DC的成熟。這與Strauss等［8］在頭頸部腫瘤的研究以及Mahnke等［9］研究報道的結論相一致，并且得到了體內外實驗的證實［10-11］。

Treg主要在機體免疫系統中發揮負向調節作用，可以抑制識別自身腫瘤細胞的效應細胞的發育和活化，在介導機體腫瘤免疫耐受中起重要作用。本研究結果顯示，Foxp3標志的Treg細胞在癌組織中的表達高于癌旁正常組織，與Viguier等［12］的結論一致。

VEGF在腫瘤免疫微環境中的作用除了對DC的成熟有影響外，也在Treg的生成中發揮一定作用［13］。研究顯示，VEGF的過度表達會導致Treg數量的增多，而抑制VEGF與其受體VEGFR結合可導致Treg數量減少，從而導致抗腫瘤活性增強；但其機制尚未明確，可能與VEGF抑制DC的成熟有關［14］。本實驗中Foxp3表達在CD1a陽性組與陰性組存在差異，且與CD1a陽性表達呈正相關，提示Foxp3+T細胞與不成熟DC有關，與Mahnke等［15］在動物實驗中的結論相一致。而這一結論也在非小細胞肺癌研究中得到證實，未成熟DC可通過誘導Treg細胞生成，而導致腫瘤的免疫逃逸。目前認為，DC影響Treg細胞介導免疫逃逸的機制主要是不成熟DC分泌TGF-b和(或)IL-10誘導初始T細胞向Treg細胞轉化，增加Treg細胞的水平［16-17］。

總之，本研究結果證實，在小細胞肺癌中，VEGF可以影響DC的成熟，進而影響Treg細胞的表達，從而導致了腫瘤的免疫逃逸，這為腫瘤的免疫治療奠定了基礎。

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