骨碎補水提液對大鼠成骨細胞OPG mRNA表達的影響

趙曉燕，劉鐘杰，李彩虹，李 琴，邢曉旭，田 丹，韓 博

（中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀100193）

骨碎補味苦、性溫，入肝、腎經(jīng)。始載于《本草拾遺》，主治腎虛腰痛，骨傷，風濕痹痛。是補腎中藥中的佼佼者，與其他中藥同等條件下作用于成骨細胞株，作用最為突出［1］。骨碎補多項臨床及動物試驗表明，其檢驗指標與骨保護素（OPG）互為聯(lián)系［2］。本試驗以大鼠成骨細胞為模型，假定骨碎補水提液能調(diào)節(jié)OPG mRNA的表達，且作用與雌激素受體通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥液制備 骨碎補飲片，購自北京同仁堂，將其和蒸餾水按1∶10（W∶V）的比例混合，文火加熱沸騰25min，濾出藥液后再加8倍蒸餾水煮沸25 min，合并兩次濾液離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成濃度為2g／mL的生藥液，調(diào)pH 值至7.2～7.4。臨用前用DMEM完全培養(yǎng)液配制成不同濃度的骨碎補培養(yǎng)液，以不加藥物的DMEM完全培養(yǎng)液作為對照組。

1.2 細胞培養(yǎng)、鑒定 新生24h內(nèi)SD大鼠，購自北京興隆實驗動物場，參照吳培福方法，體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞［3］。并通過形態(tài)學觀察、瑞氏染色和鈣化結(jié)節(jié)染色的方法對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定，鑒定成骨細胞培養(yǎng)成功。

采用第3代細胞進行試驗。細胞同步化后，試驗組換為含不同濃度骨碎補水提液、陽性對照組換為含雌二醇完全培養(yǎng)液；陰性對照組換為完全培養(yǎng)液，或者試驗組換含10mg／mL骨碎補水提液＋10－7mol／L ICI 182 780的完全培養(yǎng)液，作用48h后提取總mRNA。

1.3 細胞總 mRNA的提取 按照說明書，用Trizol法提取細胞總RNA。

1.4 RT－PCR 按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA為模板進行基因擴增，引物序列見表1，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

表1 大鼠成骨細胞中β－actin、OPG引物序列

1.5 目的基因的克隆制備 按照說明書對PCR產(chǎn)物進行純化、回收。回收產(chǎn)物與pEASY－T3載體連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，37℃ 搖床過夜培養(yǎng)后菌液送檢測序，用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性菌液質(zhì)粒。

1.6 β－actin、OPG標準曲線構(gòu)建和不同組成骨細胞中基因水平的檢測 構(gòu)建這2個基因的標準曲線，以不同處理的成骨細胞cDNA作為模板，用熒光定量PCR對基因進行檢測，通過標準曲線計算得出OPG的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05顯著性差異，P＜0.01極顯著性差異。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

不同濃度骨碎補水提液作用于成骨細胞48h后，10mg／mL組、1mg／mL組、0.1mg／mL組顯著促進OPG基因水平的表達，其中10mg／mL組作用與雌二醇組差異不顯著；0.01mg／mL、0.001 mg／mL促進作用不顯著，見圖1。

10mg／mL骨碎補水提液與雌激素受體抑制劑一同作用于成骨細胞后，促進OPG基因水平表達的作用受到抑制，見圖2。

3 討論

骨骼是代謝活躍的器官，在整個生命過程中都在進行著吸收與重建。這個過程受成骨細胞的調(diào)控：成骨細胞表達NF－κB受體活化因子配體（RANKL）與破骨細胞前體細胞表面上的NF－κB受體活化因子（RANK）結(jié)合，促進破骨細胞的分化及骨吸收；同時成骨細胞還分泌OPG，與RANKL競爭性結(jié)合，從而抑制RANKL和RANK之間的作用，以防止骨吸收過度。因此OPG、RANKL任何一方的改變都能影響骨吸收或重建的進程。

廖悅?cè)A等通過動物試驗證明，骨碎補能抑制激素缺乏引起的骨流失，對糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松也有一定作用［4－6］。大量細胞試驗證明，骨碎補提取物及其主要成分對成骨細胞或骨髓基質(zhì)細胞的增殖、分化及鈣化均有促進作用［7－9］。有試驗證明，骨碎補提取物抑制破骨細胞性骨吸收［10］。種種跡象表明，骨碎補是治療骨質(zhì)疏松的有效藥物。有試驗證明，以骨碎補主要成分的骨靈片能顯著提高去勢小鼠血清中OPG／RANKL比值［11］。本試驗中，一定濃度的骨碎補作用于成骨細胞，高劑量組顯著促進OPG基因水平的表達，低劑量組促進作用不顯著。證明骨碎補水提液能增高大鼠成骨細胞內(nèi)基因水平OPG的表達，且呈劑量依賴關(guān)系。推測，骨碎補主要通過作用于OPG影響OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)，進而影響破骨細胞的增殖分化。

本試驗中，雌激素受體抑制劑與骨碎補共同作用于成骨細胞后，骨碎補促進OPG表達作用受到抑制，與骨碎補單獨培養(yǎng)差異顯著。因此，雌激素受體通路至少是骨碎補促進OPG基因表達，增高OPG／RANKL比值的通路之一。周繼凱試驗證明，骨碎補促進小鼠成骨細胞增殖、分化是通過雌激素受體通路［12］。骨碎補通過雌激素通路對成骨細胞起作用，由此可以推測其為潛在的植物性雌激素。對骨碎補詳細的機制研究有助于其在臨床上的應用。

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