異養小球藻主要營養成分及氨基酸組成分析

董黎明，汪 蘋，李金穗，孫 陽

(北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048)

異養小球藻主要營養成分及氨基酸組成分析

董黎明，汪 蘋，李金穗，孫 陽

(北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048)

測定來自不同產地的4株蛋白核小球藻和2株橢圓小球藻異養培養后的主要營養成分和氨基酸組成，對其營養進行評價，并利用聚類和主成分分析探討異養小球藻在營養成分和氨基酸含量上的差異。結果顯示：異養小球藻主要營養成分均低于文獻報導的自養小球藻，4株異養蛋白核小球藻和2株橢圓小球藻必需氨基酸占氨基酸總量的比例分別為34.94%～37.45%和37.70%～38.32%，必需氨基酸指數分別為37.50～49.52和131.89～135.77。影響異養蛋白核小球藻營養品質的限制性氨基酸為色氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸。聚類分析將4株異養蛋白核小球藻和2株異養橢圓小球藻各歸為一類。主成分分析提取出兩個主成分因子，主成分1和主成分2的貢獻率分別為76.23%和17.80%，累積貢獻率達94.03%。

異養小球藻；營養成分；氨基酸；聚類分析；主成分分析

小球藻(Chlorella)屬綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱、小球藻屬，是一種普生性單細胞綠藻。我國常見的種類有蛋白核小球藻、橢圓小球藻和普通小球藻等。小球藻是一種高蛋白、高多糖、低脂肪、富含多種維生素及礦物質的單細胞藻類，具有多種營養保健功能[1-4]。其分布廣，生物量大，生長繁殖速度快，不僅能利用光能自養，還能進行異養高密度培養。異養培養可不受光照和溫度的影響，單位體積收獲量可達自養藻的10倍[1]，這為工業化大規模生產及其廣泛應用提供了可能[5-8]。

目前國內外在小球藻的分子生物學[9]、生長因子的提取及其生理效應[10-12]、油脂提取及生物柴油制備[13-16]、培養方式與條件優化[17]及其在食品、醫藥和環境中的應用[18]都已經開展了大量研究。小球藻中營養成分的分析是眾多研究的基礎，魏文志等[19]運用聚類和主成分分析對7種不同自養小球藻氨基酸組成及含量進行了差異性分析，而目前對不同種異養小球藻主要營養成分和氨基酸組成差異的研究鮮有報道。本實驗以6株異養培養來自不同產地的蛋白核小球藻和橢圓小球藻為研究對象，通過分析其主要營養成分及氨基酸組成，運用聚類分析和主成分分析方法，結合文獻報導的自養小球藻營養組成及含量，進行綜合比較分析，旨在為異養小球藻的營養評價、分類及應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

6株異養小球藻的名稱、來源和產地見表1。其中CE2 實驗室分離自北京玉淵潭公園八一湖，經DNA提取、PCR擴增產物測序后經同源性分析后確定。

表1 小球藻的名稱、來源與產地Table 1 Names, providers and origination of 6 types of Chlorella sp.

1.2 儀器與設備

QHZ-12B型組合式恒溫振蕩培養箱 江蘇太倉實驗儀器廠；ALPHA 1-2 LD型真空冷凍干燥機 德國Christ公司； KjeltecTM2100凱式定氮儀 丹麥FOSS公司；L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻的異養培養

小球藻采用BG11液體培養基，其配制方法為：

Stock1： 取檸檬酸0.3g、檸檬酸鐵銨0.3g、Na2-EDTA 0.05g，定容至100 mL；Stock2： 取KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O 3.75g，定容至1000mL；Stock3：取CaCl2·2H2O 1.8g，定容至100mL；Stock4： H3BO32.86g、MnCl2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·5H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g，定容至1000mL。配制1L BG11液體培養基需Stock1 2mL、Stock2 20mL、Stock3 2mL、Stock4 1mL，初始培養基KNO31.5g/L、葡萄糖40g/L。

實驗在裝液量為100mL的250mL三角燒瓶中進行。接種量為 10%，培養溫度為 25℃，起始 pH值為7.0，搖床轉速為120r/min，黑暗條件下培養。根據實驗室前期藻種異養培養生產曲線，確定達到對數生長期(第5天)時取樣，8000r/min離心10min，除去上清液，用蒸餾水洗滌藻細胞，重復離心、洗滌3次，真空冷凍干燥后研磨得藻粉，ˉ18℃密封冷凍保存備用。

1.3.2 小球藻主要營養成分的測定

小球藻細胞水分含量分析采用常壓烘箱干燥法[20]，80℃恒溫烘至質量恒定；灰分及有機質含量分析采用灼燒法[21]；粗蛋白含量分析采用凱式定氮法[22]；葉綠素測定采用丙酮提取比色法[23]；水解氨基酸、游離氨基酸測定采用分光光度法[24]。

粗脂含量測定采用超聲波提取法[25-26]：稱取0.1g藻粉置于離心管中，加2mL正己烷-異丙醇(1:1，V/V)溶液，搖勻后放入超聲儀中連續超聲萃取25min，保持溫度在(30±1)℃；萃取后于10000r/min離心10min，移取上層清液于質量為m1的離心管中，重復上述實驗兩次，105℃烘箱烘干2h，稱質量為m2，則粗脂質量為m=m2ˉm1。各營養成分含量均以干質量計。

1.3.3 氨基酸含量的測定

氨基酸組成及含量分析委托北京市營養源研究所分析檢測中心測定。樣品處理采用色氨酸以4.2mol NaOH水解，以過甲酸氧化法處理測定胱氨酸，其余氨基酸以6mol HCl水解測定，檢驗方法為GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。氨基酸含量以干質量計。

1.3.4 營養品質評價

根據FAO/WHO1973年建議的氨基酸評分標準模式(%，dry)[27]和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式(%，dry)[28]分別計算氨基酸分[3]和必需氨基酸指數(EAAI)[29]。

式中：A、B、C…I為小球藻必需氨基酸含量/%；AE、BE、CE…IE為全雞蛋蛋白質的必需氨基酸含量/%。

1.4 數據處理

使用SPSS13.0軟件進行數據處理，對6株異養小球藻的主要營養成分進行聚類分析，對氨基酸組成及含量進行聚類和主成分分析。

1.4.1 聚類分析

采用等級聚類分析，對6株異養小球藻主要營養成分、氨基酸種類及含量分別進行樣品聚類，用樹形圖顯示其親疏程度與相似性。

1.4.2 主成分分析

采用因子分析中的主成分分析，從18種氨基酸種類變量中提取2個綜合性指標(主成分1和主成分2)，并得到主成分負荷因子及其貢獻率，利用提取的主成分因子作樣品分布圖。

2 結果與分析

2.1 異養小球藻粉的主要營養成分含量

表2 異養小球藻主要營養成分含量Table 2 Contents of main nutritional components in heterotrophic Chlorella sp.g/100g

由表2可以看出，4株異養蛋白核小球藻(CP1、CP2、CP3、CP4)的粗蛋白、總葉綠素和水解氨基酸含量均高于2株異養橢圓小球藻(CE1、CE2)，其平均值分別是橢圓小球藻的2.1倍、3.7倍和2.2倍。CP2的粗蛋白和總葉綠素含量最高，分別為36.25g/100g和122.20g/100g，CP3的水解氨基酸含量最高為30.85g/100g。這可能是由于蛋白核小球藻更適合于異養培養，也是目前研究中報道最多的異養培養藻種[3,17]。2株橢圓小球藻的粗油脂平均含量則是蛋白核小球藻的1.7倍，CE1粗油脂含量最高達60.2g/100g，說明異養橢圓小球藻在油脂利用方面有更加廣闊的研究和應用前景。

在同種小球藻的主要營養成分對比上，4株蛋白核小球藻的粗蛋白、游離氨基酸和水解氨基酸的含量差異不大，而在總葉綠素和粗脂含量上差異較大。CP2的總葉綠素含量(122.20g/100g)是CP4的(35.64g/100g)3.4倍，CP1的粗脂含量(41.90g/100g)是CP2(23.6g/100g)的1.8倍。CE1的粗脂、粗蛋白和水解氨基酸含量均明顯高于CE2，但總葉綠素和游離氨基酸的含量僅為CE2的近1/3和1/2。這種同種異養小球藻主要營養成分的差異說明不同產地的小球藻對異養培養的適應存在差異性。

與文獻報道的自養小球藻營養成分進行對比，異養蛋白核小球藻的粗蛋白平均含量僅為文獻值(53.79g/100g)[19]的63%，總葉綠素平均含量僅為文獻值(28.61mg/g)[17]的32%；異養橢圓小球藻的粗蛋白平均含量僅為文獻值(43.81g/100g)[19]的37%，導致這種差異的原因在于異養(無光照)生長小球藻的代謝方式和途徑與自養生長(有光照)相比發生了很大的改變[17]。說明異養培養降低了小球藻的營養成分含量，但是由于異養培養大大提高了小球藻的產量[1]，因此小球藻異養培養的綜合效益依然顯著。

2.2 異養小球藻氨基酸的組成及含量

表3 異養小球藻氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid composition of heterotrophic Chlorella sp. g/100g

蛋白質中所含必需氨基酸的種類、數量和構成比例決定了其營養價值。由表3可見，6株異養小球藻中均含有18種氨基酸，并包括人體所需的8種必需氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的含量較高，蛋氨酸、組氨酸、胱氨酸的含量較低，色氨酸的最低，僅為0.03～0.17g/100g，且各氨基酸含量的高低順序基本一致。異養橢圓小球藻中必需氨基酸占氨基酸總量(EAA/TAA，E/T)(37.70%～38.32%)和必需氨基酸與非必需氨基酸比值(EAA/NEAA，E/N)(60.50%～62.12%)均大于異養蛋白核小球藻的E/T和E/N比，但兩者均接近世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)提出的蛋白質中EAA/TAA應達到40%、EAA/NEAA應大于60%的參考模式。

在同種小球藻的氨基酸含量比較上，CP1的大多數氨基酸含量、EAA和TAA均低于其他3株異養蛋白核小球藻，CE1的主要氨基酸含量、EAA和TAA則大于CE2。從蛋白質的營養價值來看，CP3和CE2的EAA/TAA和EAA/NEAA的比值均高于其他同類小球藻，更接近于FAO/WHO的參考蛋白模式值。

表4 異養小球藻必需氨基酸組成評價(FAO/WHO建議模式)Table 4 Evaluation of EAA composition of heterotrophic Chlorella sp. with FAO/WHO mode

與文獻報道的自養小球藻氨基酸組成及含量進行對比，異養小球藻除蛋氨酸、精氨酸和胱氨酸外，其他15種氨基酸的含量均遠遠低于自養小球藻。異養蛋白核小球藻的EAA和TAA則幾乎是自養蛋白核小球藻的一半，異養橢圓小球藻的EAA和TAA是自養橢圓小球藻的3/4。這與異養小球藻主要營養成分的分析對比一致，說明異養培養降低了小球藻的營養物質含量。同時，異養小球藻的EAA/TAA和EAA/NEAA比只是略低于自養小球藻，說明營養物質含量的降低并未顯著改變小球藻的營養價值。

2.3 必需氨基酸組成評價

通過計算異養小球藻必需氨基酸占粗蛋白質的含量，與FAO/WHO的建議蛋白模式和全雞蛋蛋白模式進行比較，得出6株異養小球藻的氨基酸分和必需氨基酸指數，見表4、5。

表5 異養小球藻必需氨基酸組成評價(全雞蛋模式)Table 5 Evaluation of EAA composition of heterotrophic Chlorella sp. with Eggs mode

由表4、5兩種模式的氨基酸組成評價可以看出，異養蛋白核小球藻的必需氨基酸組成幾乎均低于相應的FAO/WHO建議模式和全雞蛋模式的參考值。Trp的含量偏低最大，為第一限制性氨基酸，CP1、CP2和CP3的Thr的含量僅為建議模式的一半多，為第二限制性氨基酸，CP4的Ile為第二限制性氨基酸。若不考慮第一限制性氨基酸分，第二性氨基酸分和EAAI指數均為標準參考模式的一半左右，應該屬于植物蛋白質這一等級。與文獻報導的自養蛋白核小球藻的EAAI指數值57.69[19]相比也是偏低，再次證明了異養培養降低了蛋白核小球藻的營養品質，這與主要營養成分和氨基酸含量的結論一致。

然而，異養橢圓小球藻的必需氨基酸組成幾乎均遠高于相應的FAO/WHO建議模式和全雞蛋模式的參考值，僅Trp的含量接近或低于標準值，是CE2的限制性氨基酸。CE1的氨基酸分和EAAI指數、CE2的第二氨基酸分和EAAI指數均高于標準參考模式，也明顯高于文獻報導的自養橢圓小球藻的EAAI指數值65.39[19]，說明異養培養的橢圓小球藻氨基酸組成品質更高。

2.4 聚類分析

對6株異養小球藻主要營養成分和氨基酸含量分別進行聚類分析，得到小球藻營養成分和氨基酸含量聚類圖(圖1、2)。結果顯示，無論在小球藻主要營養成分還是氨基酸含量上，4株蛋白核小球藻可聚為一類，2株橢圓小球藻可聚為一類，說明異養蛋白核小球藻與橢圓小球藻差異顯著。在4株異養蛋白核小球藻之間，CP1、CP2和CP3在營養成分和氨基酸含量上更為接近，與CP4的差異顯著。在2株橢圓小球藻之間，CE1和 CE2在氨基酸含量的差異要明顯大于主要營養成分的差異，說明異養培養時不同產地和來源的橢圓小球藻對其氨基酸品質影響要大于蛋白核小球藻。

圖1 異養小球藻主要營養成分聚類分析樹形圖Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram for main nutritional components of heterotrophic Chlorella sp.

圖2 異養小球藻氨基酸組成聚類分析樹形圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram for amino acid of heterotrophic Chlorella sp.

2.5 主成分分析

對6株異養蛋白核小球藻氨基酸組成進行主成分分析得主成分負荷因子及其貢獻率如表6所示。主成分1(PC1)的貢獻率為76.23%，主成分2(PC2)的貢獻率為17.80%，兩個因子的累積貢獻率即達94.03%，說明用兩個因子即可概括6株異養小球藻之間的差異。按照主成分的負荷因子，主成分1主要包括了Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val和Leu等氨基酸信息，主成分2主要包括Arg和Cys等負荷因子。與文獻[19]提取的3因子相比，本研究主成分分析提取的2個因子即可概括異養蛋白核小球藻和橢圓小球藻在氨基酸組成上的差異，在主成分因子所代表的氨基酸信息上，主成分1均包含了Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、Val和Leu等氨基酸信息，但在主成分2上差異顯著。

表6 主成分負荷因子及其貢獻率Table 6 Loading factors and contribution rates of two principal components from heterotrophic Chlorella sp.

將提取的PC1和PC2作6株異養小球藻氨基酸組成分布圖(圖3)?？梢钥闯?，4株異養蛋白核小球藻中CP2和CP3最為接近，CP1較為接近，CP4在PC2軸上距離較遠，這和聚類分析中圖2的結果一致。而2株異養橢圓小球藻CE1和 CE2則主要在PC2軸上差異顯著。橢圓小球藻和異養蛋白核小球藻在PC1和PC2軸方向均差異顯著。

圖3 主成分因子表達的異養小球藻氨基酸組成分布Fig.3 Distribution of amino acid for heterotrophic Chlorella sp. with extracted principle component factors

3 討 論

異養培養小球藻由于生長繁殖比自養培養快得多，一直備受研究者關注，一些異養培養的蛋白核小球藻最高生物量是自養培養的近50倍[17]。然而，異養培養卻顯著降低了小球藻的營養物質含量，本實驗中異養蛋白核小球藻與橢圓小球藻在粗蛋白、葉綠素和氨基酸含量上均明顯小于文獻報導的自養蛋白核與橢圓小球藻。導致這種差異的原因一方面在于異養(無光照)生長小球藻的代謝方式和途徑與自養生長(有光照)相比發生了很大的改變[17]，另一方面異養培養的營養鹽、C/N、接種量及溫度、pH值等培養條件也會對小球藻中蛋白質等營養物質的含量產生影響[23]。本實驗中相同培養條件下4株異養蛋白核小球藻在粗蛋白、水解氨基酸及總必需氨基酸含量上的較小差異，可能是不同產地藻種的自身蛋白質含量差異的原因。

蛋白質的營養價值體現在氨基酸組成及含量，尤其是8種人體必需氨基酸的組成及含量。盡管異養培養降低了蛋白核和橢圓小球藻必需氨基酸和總氨基酸含量，但在必需氨基酸組成及營養品質上，異養蛋白核和橢圓小球藻仍接近于FAO/WHO提出的蛋白質中EAA/TAA應達到40%、EAA/NEAA應大于60%的參考模式[27]，說明異養培養的小球藻仍具有較高的營養價值。

氨基酸分和必需氨基酸指數(EAAI)用于評價蛋白質的質量，兩者越接近100說明其與標準蛋白的必需氨基酸組成越接近，營養價值越高[3,29]。本研究中異養橢圓小球藻的氨基酸營養品質要優于異養蛋白核小球藻，其EAAI指數均優于全雞蛋蛋白模式。

聚類分析可將不同藻株進行初步分類，根據其差異大小，分析藻株間的差異程度。本實驗結果表明，4株異養蛋白核小球藻和2株異養橢圓小球藻差異顯著，說明不同藻種間在營養成分和氨基酸含量上差異明顯，這首先應該是二者自身遺傳物質的差異決定的。3株異養蛋白核小球藻CP1、CP2和CP3在營養成分和氨基酸含量上更為接近，而2株橢圓小球藻CE1和 CE2在氨基酸含量的差異要明顯大于主要營養成分的差異。這種引起同種間營養成分差異的原因還有待深入研究。

主成分分析是將18種氨基酸通過線性變換以提取幾個重要因子的一種多元統計分析方法，根據所提取因子所代表的含義可以更輕易表達藻株在氨基酸含量上的差異。本研究將18種氨基酸綜合為兩個主成分因子，累積貢獻率達94.03%。根據所提取因子的散點圖可以判別藻株在各軸的分布及差異，進而說明各因子所代表的氨基酸含量差異，這比聚類分析提供的信息更加詳細，也可作為類似研究的分析指標，主成分分析方法使不同小球藻氨基酸差異分析更為簡單。但小球藻在異養和自養培養條件下營養成分含量和品質差異的內在機理還有待進一步深入研究。

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Analysis of Nutritional Components and Amino Acid Composition of Heterotrophic Chlorella sp.

DONG Li-ming，WANG Ping，LI Jin-sui，SUN Yang
(Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Four strains of Chlorella pyrenoidosa and 2 strains of Chlorella ellipsoidea under heterotrophic culture were analyzed for nutritional components and amino acid composition. Cluster analysis and principle component analysis were conducted to distinguish the differences among the heterotrophic strains of Chlorella sp.. The results showed that the contents of main nutritional components of the heterotrophic strains of Chlorella sp. were lower than previously reported results for autotrophic Chlorella sp.. The ratios of essential to total amino acids of the strains of Chlorella pyrenoidosa and Chlorella ellipsoidea were 34.94%ˉ 37.45% and 37.70%ˉ38.32%, and the essential amino acid indexes 37.50ˉ49.52 and 131.89ˉ135.77, respectively. The limiting amino acids affecting the nutritional quality of 4 strains of Chlorella pyrenoidosa were Trp, Thr and Ile. The results of cluster analysis indicated that 4 strains of Chlorella pyrenoidosa and 2 strains of Chlorella ellipsoidea could be assigned to two different clusters according to the contents of nutritional components and amino acids. Two principal components were extracted to reveal a contribution rate of 76.23% for the first principle component and 17.80% for the second principle component. The cumulative contribution rate of the principal components was up to 94.03%.

heterotrophic Chlorella sp；nutritional components；amino acid；cluster analysis； principal component analysis

Q517

A

1002-6630(2012)03-0232-06

2011-10-25

環境保護部環保公益性項目(200909029)

董黎明(1974—)，男，講師，博士，研究方向為環境微生物。E-mail：donglm@btbu.edu.cn