7種食品防腐劑對肉制品污染微生物的抑菌效果比較研究

楊曉韜， 李 春,2， 周曉宏*

(1.石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學生命學院，北京 100081)

7種食品防腐劑對肉制品污染微生物的抑菌效果比較研究

楊曉韜1， 李 春1,2， 周曉宏2,*

(1.石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學生命學院，北京 100081)

通過測定抑菌率和最低抑菌質量濃度，研究化學防腐劑山梨酸鉀、雙乙酸鈉、單辛酸甘油酯、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)以及生物防腐劑乳酸鏈球菌素(Nisin)、殼聚糖、ε-聚賴氨酸(ε-PL)對12株肉制品腐敗(包括2株環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、2株凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、1株蜂房哈夫尼亞菌(Hafnia alvei)以及1株腸球菌(Enterococcus))的抑菌活性。結果表明：7種防腐劑對供試菌都有一定的抑菌效果，抑菌效果強弱順序為：Nisin＞殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞EDTA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。3種生物防腐劑的抑菌效果明顯強于其他4種化學防腐劑。通過比較各種防腐劑對不同種和同種不同株的細菌的抑菌效果，表明同一種防腐劑不僅對不同種的細菌抑菌效果不同，即使對同種不同株的細菌其抑菌效果也有很大差異。

食品防腐劑；肉制品腐敗；抑菌效果

肉類制品具有極高的營養價值和獨特的感官性質，能給人體提供必需的蛋白質、脂類、碳水化合物、無機鹽及維生素等多種營養素，是人類膳食結構的重要組成部分[1]。隨著人類食物品種的增多、銷量的增長，危害肉類制品食品安全的因素也隨之增多，使肉類制品食品安全問題日趨復雜，在眾多導致肉類制品安全問題的因素中，微生物污染是最主要的因素[2]。因此防止肉類制品由微生物引起的腐敗，增加其安全性，減少肉類制品因污染引起的浪費是肉制品加工企業必須解決的關鍵問題[3]。為了有效抑制肉制品中微生物的生長，延長肉制品的保質期，加強其安全性，在肉制品加工過程中，人們采用了許多不同的手段來殺死或者抑制微生物，其中添加防腐劑是最方便且有效的一種方法，因而被廣泛使用于肉制品加工行業中[4]。

食品防腐劑，即用于防止食品因微生物引起的變質，提高食品保存性能，延長食品保質期而使用的食品添加劑[5]。我國現行的GB2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》允許使用的防腐劑共有27種，其抑菌效果已有不少報道，但因各學者實驗用菌種及其來源不同，即使用同一種菌，若菌株不同或已發生變異其結果也會不同[6]，且實驗條件也不一致，因此難以從現有文獻中全面衡量各種食品防腐劑對肉制品腐敗菌的抑制作用。為此，本實驗從不同來源的腐敗肉制品中分離篩選出6種共12株細菌，研究7種常用的食品防腐劑對不同菌種以及同種不同株的細菌之間的抗菌活性差異，旨在為肉制品和其他食品的防腐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、雙乙酸鈉、EDTA(均為食品級) 北京北方霞光食品添加劑有限公司；單辛酸甘油酯 杭州康源食品科技有限公司；Nisin、ε-聚賴氨酸(ε-PL) 浙江銀象生物工程有限公司；殼聚糖(脫乙酰度97.6%) 山東省萊州市海力生物制品有限公司；其余試劑均為分析純。

2株環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、2株凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、蜂房哈夫尼亞菌(Hafnia alvei)、腸球菌(Enterococcus)分離自不同來源的腐敗肉制品。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

肉制品模擬培養基(meat simulating medium，MSM)、肉制品模擬瓊脂培養基(meat simulating and agar medium，MSMA)，是在劉堅真等[7-9]優化的測定食品細菌總數培養基配方的基礎上，結合肉制品成分進一步優化的食品微生物通用培養基。MSM配方：酵母膏2.5g、牛肉膏1.0g、葡萄糖1.0g、胰蛋白胨5.0g、NaCl 8.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2，115℃滅菌20min。其中用酵母膏和牛肉膏模擬肉制品中的蛋白成分，用葡萄糖模擬肉制品中的淀粉等多糖成分。在MSM基礎上添加15g/1000mL瓊脂粉即為MSMA。

1.2.2 菌懸液的制備

將6種12株細菌(除蜂房哈夫尼亞菌為革蘭氏陰性菌之外，其余5種均為革蘭氏陽性菌)分別在MSMA斜面培養基上32℃條件下培養24h活化，活化后的菌種用接種環在斜面接一環于MSM中，在32℃條件下培養24h，采用平板計數法測定菌體濃度，將培養液稀釋為含菌體107CFU/mL的菌懸液，4℃冰箱暫存備用。

1.2.3 抑菌活性的測定

首先將7種防腐劑配制成質量濃度分別為100、10、 1mg/mL的溶液，殼聚糖溶液中添加一定量的乳酸以使其溶解。Nisin溶液用無菌水在無菌操作臺中配制，其余防腐劑溶液配好后經121℃滅菌20min， 4℃冰箱暫存備用。在含有8.9mL MSM的試管中，實驗組加入1mL防腐劑溶液，0.1mL菌懸液；陽性對照組用無菌水取代防腐劑，陰性對照組用MSM取代菌液(用于比濁法調零，平板稀釋法無陰性對照)。所有試管中的培養液總體積均為10mL，使各防腐劑的終質量濃度分別為10、1、0.1mg/mL。將體系充分混勻后于32℃條件下培養48h。取出試管，充分振蕩，并對各試管進行逐個檢查，用肉眼觀察其混濁程度。

平板稀釋法：用于單辛酸甘油酯、ε-PL、殼聚糖、Nisin抑菌活性的測定。將上述培養液經不同質量濃度稀釋，各取0.1mL涂平板，32℃條件下培養24h，計數，與陽性對照比較，并以此表征防腐劑的抗菌活性。

比濁法：用于山梨酸鉀、雙乙酸鈉、EDTA抑菌活性的測定。以陰性對照為空白參比，用紫外分光光度計于620nm波長處測定培養液的濁度(OD值)，與陽性對照比較，并以此表征防腐劑的抗菌活性。

平板稀釋法抑菌率的計算[10]：

1.2.4 最低抑菌質量濃度(MIC)的測定

MIC的測定：首先根據防腐劑3種質量濃度(10、1、0.1mg/mL)的抑菌率初步確定其MIC的范圍，在此范圍內設定密集的質量濃度梯度并測定其抑菌率，選擇抑菌率為100%的防腐劑質量濃度，即為防腐劑的最低抑菌質量濃度(MIC)[11]。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度的防腐劑對各種細菌的抑菌率

由圖1～3可知，7種防腐劑對各種細菌都有一定的抑菌作用，且抑菌效果隨著防腐劑質量濃度的增大而加強。總體來看，Nisin、殼聚糖和ε-PL的抑菌效果明顯優于其他防腐劑，EDTA和單辛酸甘油酯次之，而山梨酸鉀對6種供試菌的抑菌效果最不明顯，低質量濃度時甚至有助于部分細菌(如腸球菌)的生長，雙乙酸鈉效果也不太好。值得關注的是Nisin對5種革蘭氏陽性菌的抑菌效果十分明顯，質量濃度為0.1mg/mL時，其抑菌率幾乎都可以達到100%，但是對于革蘭氏陰性的蜂房哈夫尼亞菌抑菌效果卻只有2%，質量濃度為1mg/mL和10mg/mL時，其抑菌率也只能達到35%和75%；ε-PL也有和Nisin類似的趨勢，只是程度不同而已；而殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌效果最好，質量濃度為0.1mg/mL時，雖然其抑菌率只有39%，但在7種防腐劑中為最高，當質量濃度升高到1mg/mL時，其抑菌率已達到100%。

圖1 質量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of bacteria

圖2 質量濃度為1mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of bacteria

圖3 質量濃度為10mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of bacteria

2.27 種食品防腐劑對同種不同株細菌的抑菌效果比較

2.2.17 種防腐劑對2株環狀芽孢桿菌的抑菌效果

圖4 質量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對環狀芽孢桿菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus circulans

由圖4可知，質量濃度為0.1mg/mL的7種防腐劑對環狀芽孢桿菌的抑菌率大小為：Nisin、殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞ED TA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。其中Nisin、殼聚糖對兩株菌的抑菌率都為100%；單辛酸甘油酯、ε-PL和EDTA 3種防腐劑對環狀芽孢桿菌-1和環狀芽孢桿菌-2的抑菌效果有差異但不明顯，抑菌率相差不超過5%；雙乙酸鈉對2株菌的抑菌效果相差較大，對環狀芽孢桿菌-1的抑菌率不足15%，而對環狀芽孢桿菌-2的抑菌率接近50%；而該質量濃度的山梨酸鉀對2株菌都沒有抑菌效果。

2.2.27 種防腐劑對2株凝結芽孢桿菌的抑菌效果

圖5 質量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對凝結芽孢桿菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus coagulans

由圖5可知，質量濃度為0.1mg/mL時，Nisin、殼聚糖、ε-PL對2株來源不同的凝結芽孢桿菌的抑菌率都達到100%；EDTA對兩株菌的抑菌率分別接近90%和80%；雙乙酸鈉對凝結芽孢桿菌-1的抑菌率為0，對凝結芽孢桿菌-2只有微弱的抑菌效果；單辛酸甘油酯對凝結芽孢桿菌-1的抑菌率為0，但對凝結芽孢桿菌-2的抑菌率達到90%以上，差異巨大；而該質量濃度的山梨酸鉀對2株菌同樣沒有抑菌效果。

2.2.37 種防腐劑分別對3株地衣芽孢桿菌的抑菌效果

圖6 質量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對地衣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.6 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus licheniformis

由圖6可知，雖然3株地衣芽孢桿菌來源相同，但是結果表明，同種防腐劑對3株菌的抑菌效果依然有不同程度的差異。Nisin和ε-PL的抑菌率最高，在99%以上，且對3株菌的抑菌效果基本一致；殼聚糖和EDTA都有明顯的抑菌效果，但是3株菌之間也一定的差異；而山梨酸鉀、雙乙酸鈉、單辛酸甘油酯對3株菌的抑菌效果有很大差異，山梨酸鉀對地衣芽孢桿菌-1的抑菌率超過80%，而對地衣芽孢桿菌-2和地衣芽孢桿菌-3卻沒有抑菌作用；相反，單辛酸甘油酯對地衣芽孢桿菌-1的抑菌率為0，但對地衣芽孢桿菌-2和地衣芽孢桿菌-3的抑菌率卻都在97%以上。由此可見，即使是來源相同的同種不同株的細菌，同一種防腐劑對它們的抑菌效果往往也會出現明顯的差別。

2.2.47 種防腐劑分別對3株枯草芽孢桿菌的抑菌效果

圖7 質量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus subtilis

由圖7可知，Nisin對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌率都在98%以上；殼聚糖次于Nisin，但抑菌率也都超過92%；ε-PL雖不及Nisin和殼聚糖，但抑菌率也都在80%以上。而其余4種防腐劑的抑菌效果在3株菌之間都有較大的差異，雖然前2株菌來源相同，但山梨酸鉀、雙乙酸鈉以及EDTA對二者的抑菌效果差異明顯。

2.37 種食品防腐劑的最低抑菌質量濃度(MIC)分析

表1 7種食品防腐劑對細菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of bacteria mg/mL

表1為7種食品防腐劑對12株肉制品腐敗菌的最低抑菌質量濃度測定結果，MIC值越低，相應食品防腐劑的抑菌作用越強。可以看出，Nisin對革蘭氏陽性菌都有很強的抑菌作用，在7種防腐劑中，它的最低抑菌質量濃度都是最小的，但是對于革蘭氏陰性的蜂房哈夫尼亞菌，它的抑菌效果卻不明顯；殼聚糖對革蘭氏陽性菌的最小抑菌質量濃度雖然比Nisin略大，但優于其他防腐劑，尤其是Nisin抑菌效果不好的蜂房哈夫尼亞菌，殼聚糖對它的最低抑菌質量濃度是最小的。而山梨酸鉀對各株菌的最小抑菌質量濃度明顯高于其他防腐劑，其抑菌效果在7種防腐劑中是最差的，分析其原因可能有以下三方面：首先山梨酸鉀對霉菌、酵母和好氣性菌均有抑制作用，但對嫌氣性芽孢形成菌與嗜酸乳桿菌則幾乎無效[12]，即山梨酸鉀并不是廣譜的防腐劑；同時山梨酸鉀屬于酸性防腐劑，其防腐效果隨pH值升高而降低，適用于pH5.5以下的食品防腐；此外山梨酸鉀的抑菌作用比抗菌作用強，有研究表明將其加入已經污染了大量微生物的食品中，則基本無效[13]。

各防腐劑最低抑菌質量濃度綜合排序：Nisin＜殼聚糖＜ε-PL＜單辛酸甘油酯＜EDTA＜雙乙酸鈉＜山梨酸鉀。

2.4 Nisin、殼聚糖、ε-PL抑菌作用的構效分析

與其他4種化學防腐劑相比，3種生物防腐劑Nisin、殼聚糖、ε-PL使用劑量低且防腐效果好，同時具有安全、天然、健康的特點，因而倍受人們的關注[12]。

Nisin是一種兩親型，由34個氨基酸組成的帶正電荷的小肽，可以作用在細胞壁帶負電荷的陰離子成分上，如細胞壁的磷壁酸、糖醛酸、脂磷壁酸、酸性多糖或細胞膜的磷脂上，并形成孔狀結構，引起細胞膜的滲漏，導致小分子質量的細胞成分如鉀離子、氫離子、氨基酸、核苷酸(如ATP、ADP)等物質迅速流出，從而引起細胞死亡[13]。從Nisin的抑菌譜來看，Nisin對革蘭氏陽性細菌的抑菌效果明顯優于革蘭氏陰性細菌。這是由于革蘭氏陰性細菌的細胞壁肽聚糖含量少，但組成復雜。主要包括磷脂、蛋白質和脂多糖(LPS)等，十分致密，僅允許分子質量小于600D的分子通過。Nisin的分子質量為3500D左右，無法正常通過革蘭氏陰性細菌細胞壁，因此也就無法達到細胞膜[14]。

殼聚糖是一種天然多聚陽離子生物多糖[15]，分子結構中含有羥基和氨基，因此，各分子之間能夠形成氫鍵，并且氨基葡萄糖單體的C2位上的氨基在pH6以下時質子化后帶有正電荷，因而可以與細胞表面上帶有負電荷的分子基團相互作用而改變細胞的通透[16]，導致細菌細胞內組分如蛋白質與葡萄糖等的泄漏[16-18]，也有可能在細胞表面形成一層高分子膜，阻止了營養物質向細胞內的運輸，從而起到抑菌殺菌作用[19-20]。

ε-PL呈高聚合多價陽離子態，其抑菌機理可能是由于它可以作用于生物膜系統和蛋白合成系統，與核糖體結合從而抑制蛋白和酶生物大分子的合成，結合在生物膜上的ε-PL破壞膜結構完整性，使細胞的選擇性改變，引起細胞的物質、能量和信息傳遞中斷，呼吸作用受到影響，細菌能量代謝和物質代謝破壞，能量物質ATP和還原物質NADH虧缺，合成代謝受阻，導致胞內溶酶體膜破裂而誘導微生物產生自溶作用，最終使細胞死亡[21]。

由于細菌表面均帶負電荷，所以這3種防腐劑對大部分細菌具有較好的抑菌效果，是更加安全可靠的新一代食品防腐劑[22]。

3 討 論

本實驗對山梨酸鉀、Nisin、殼聚糖等7種食品防腐劑進行了抑菌效果的比較研究。結果表明7種防腐劑對各種供試菌都有不同程度的抑菌效果，防腐劑質量濃度越高其抑菌效果越好。總體來看，7種供試防腐劑抑菌效果強弱順序為：Nisin＞殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞EDTA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。同一種防腐劑，特別是抑菌效果中等的防腐劑，不僅對不同種的細菌抑菌效果不同，而且對于同種不同株的細菌，其抑菌效果也不盡相同，甚至相差很大。因此，對于防腐劑的抑菌效果，不能單純以菌種來定論，應具體到所涉及的每一株菌。對于大多數供試菌而言，Nisin、殼聚糖、ε-PL的抑菌效果最好，其最低抑菌質量濃度遠遠小于山梨酸鉀。隨著人們生活和消費水平的提高，人們對肉制品安全提出了更高的要求，肉制品加工企業為了順應市場的變化，其產品也越來越向“綠色”和“天然”等方向轉變[23]，本實驗也進一步證明了生物防腐劑比化學防腐劑更為高效、廣譜，因此，天然、安全的生物防腐劑將是未來防腐領域的重點。

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Comparison of Antibacterial Effects of Seven Food Preservatives on Spoilage Microorganisms in Meat

YANG Xiao-tao1，LI Chun1,2，ZHOU Xiao-hong2,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, China；2. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

The antibacterial activities of food preservatives including potassium sorbate, sodium diacetate, capryl monoglyceride, disodium ethylene-diamine-tetraacetate (EDTA), nisin, chitosan and ε-polylysine (ε-PL) against 12 meat spoilage strains such as 2 Bacillus circulans strains, 3 Bacillus subtilis strains, 3 Bacillus licheniformis strains, 2 Bacillus coagulans strains, 1 Hafnia alvei strain and an Enterococcus strain were investigated based on inhibitory rate and minimum inhibitory concentration. The results showed that seven food preservatives had inhibitory effect on all tested bacteria at different levels. They could be ranked in decreasing order of antibacterial activity as follows: nisin＞chitosan ＞ε-PL＞capryl monoglyceride＞EDTA ＞sodium diacetate＞potassium sorbate. Three bio-preservatives including nisin, chitosan and ε-PL had better antibacterial activity than other four chemical preservatives. In addition, the antibacterial activity of 7 preservatives exhibited great differences among species and among different strains from the same species.

food preservative；meat spoilage；antibacterial activity

TS202.3

A

1002-6630(2012)11-0012-05

2011-06-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B01；2011BAC11B06)

楊曉韜(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品添加劑生物技術。E-mail：yangxiaotao521@126.com

*通信作者：周曉宏(1965—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhouxh@bit.edu.cn