茶樹油、丁香酚和檸檬醛對荔枝黑曲霉的抑制作用

鐘業俊，徐欣源，劉成梅,*，孫 健，吳建永，劉桃英

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.廣西農業科學院農產品加工研究所，廣西 南寧 530007)

茶樹油、丁香酚和檸檬醛對荔枝黑曲霉的抑制作用

鐘業俊1，徐欣源1，劉成梅1,*，孫 健2，吳建永1，劉桃英1

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.廣西農業科學院農產品加工研究所，廣西 南寧 530007)

研究茶樹油、丁香酚和檸檬醛的揮發性香氛對荔枝致腐真菌黑曲霉的抑制作用，采用復配方法探究3種香料對黑曲霉的協同抑菌性。結果表明：丁香酚和檸檬醛的揮發性香氛對黑曲霉有較強的抑制作用，最低抑菌濃度分別為0.3μL/cm3和0.4μL/cm3；茶樹油揮發性香氛抑制黑曲霉的作用稍差，但與丁香酚和檸檬醛復配后協同抑菌作用增強。

茶樹油；丁香酚；檸檬醛；黑曲霉；抑菌作用

由于荔枝果實特殊的形態生理結構，以及在盛夏高溫季節成熟等原因，采后真菌的繁殖生長是導致荔枝在存貯運輸期間腐爛變質的重要原因，而一般化學保鮮劑由于具有不安全因素[1]，已經造成人們的恐懼和抵觸，作為替代的天然保鮮劑則受到越來越多的關注。

香辛料來源于植物的種子、花蕾、葉莖、根塊等，具有特殊的生理藥理作用，其中一部分還有抗菌防腐作用。Thyagaraja等[2]研究發現香辛料的乙醇提取物對致腐真菌如曲霉、根霉、毛霉有較強的抑制效果。Weerakkody等[3]研究高良姜、藤黃、山胡椒等的體外抑菌實驗時發現香料的抑菌效果與其在溶劑中的溶解性呈正相關。Cerrutti等[4]發現香草醛對蘋果皮表面致腐酵母菌的生長有抑制作用，并有助于延長蘋果的保質期。Nielsen等[5]發現香料精油對面包致霉微生物具有很明顯的抑制作用。此外，朱玉生[6]、吳克剛[7]等利用香辛料與致腐真菌直接接觸，取得了較好的抑菌效果。張寬朝等[8]研究發現，直接用香料揮發出來的香氛進行抑菌簡便易行，可以避免由于香料疏水性導致的涂膜分布不均、抑菌效果下降的現象，且香氛抑菌并不直接接觸果蔬表面，安全可靠。

本實驗以茶樹油、丁香酚和檸檬醛為抑菌劑，研究其揮發性香氛對導致荔枝腐爛的黑曲霉的抑菌效果，以及3種抑菌劑的協同增效作用，以期為揮發性香料用于荔枝保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝黑曲霉(Aspergillus niger)由南昌大學中德食品工程中心自腐爛荔枝果實上挑取少量病原菌孢子[9]經連續稀釋法分離篩選[10]得來。使用的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)以及查氏酵母膏瓊脂培養基(CYA)[10]。通過對該菌株菌落及菌體的形態學觀察，根據《中國真菌志 曲霉屬及其相關有性型》[11]以及《Identification of Common Aspergillus Species》[12]對分離出來的病原菌進行分類鑒定，符合黑曲霉特征。

丁香酚(純度≥95%，批號110725-200610)、檸檬醛(純度≥95%，為其異構體牻牛兒醛(geranial)和橙花醛(nersal)的混合物，相對密度0.893(25℃)，沸點228～229℃，批號113898-200912) 上海恒遠生物科技有限公司。

茶樹油(Melaleuca alternifolia)，無色液體，采用湛江市麻章區種植的白千層樹，2010年10月經中國熱帶農業科學院農產品加工研究所提取獲得，各項指標均達到國際標準ISO4730-1996《白千層萜品醇油(茶樹油)》要求。檢出主要技術指標：異松油烯3.83%、1.8-桉葉素4.63%、α-松油烯10.42%、γ-松油烯20.26%、對傘花烴2.34%、松油烯醇-4 35.62%、α-松油醇2.97%、葶烯1.64%、檜烯0.36%、香樹烯1.02%、δ-杜松烯0.64%、藍桉醇0.58%、綠花白千層醇0.25%、α-蒎烯2.86%；20℃時折光指數1.48，相對密度0.890，旋光度7.45°。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

采用馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA培養基)[8]。稱取去皮洗凈后的新鮮土豆200g，加水800mL煮沸至土豆煮透煮爛，此過程大約20～30min。4層紗布過濾，取濾液。向濾液中加入300mL蒸餾水、20g葡萄糖，攪拌均勻后繼續加熱煮沸。稱取20g瓊脂，用剪刀剪成小塊后加入沸騰的濾液中，同時不斷用玻璃棒進行攪拌，促進瓊脂溶解均勻并防止結底。待全部溶解后分裝入錐形瓶中，滅菌備用。

1.2.2 霉菌菌餅的制備

選用直徑為9cm的無菌培養皿，倒入經高溫滅菌的PDA培養基，制成平板。待冷凝后用黑曲霉孢子的生理鹽水懸浮液進行涂布。30℃培養72h，使菌絲均勻生長。用直徑為5mm的打孔器在上述長滿菌絲的培養基上打孔，切下帶菌培養基制取菌餅備用[13]。

1.2.3 菌餅的移植

準備直徑9cm的潔凈無菌培養皿，倒入等量無菌PDA培養基，立即將制備好的菌餅用挑針挑取后菌絲面向上放置在培養皿的中央，待培養基完全冷凝后，將培養皿倒置于無菌操作臺上。

1.2.4 單一香料揮發氣氛對黑曲霉的抑制實驗

倒有PDA培養基的培養皿內部體積基本一致，約為30cm3。由此進行實驗設計，考察茶樹油、檸檬醛和丁香酚濃度對黑曲霉抑制的影響，分為3個實驗組：1)分別加入3、6、12、18μL茶樹油，即茶樹油的濃度對應為0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3(以空氣體積計算，下同)。2)分別加入3、6、9、12μL檸檬醛，對應濃度為0.1、0.2、0.3、0.4μL/cm3。3)分別加入3、6、9、12μL丁香酚，對應濃度為0.1、0.2、0.3、0.4μL/cm3。

1.2.5 抑菌率的測定

采用菌絲生長速率抑菌率法[9]作為抑菌效果的評價指標。將香料溶液均勻添加到無菌棉紙(5.5mm×6.5mm)上，迅速貼于移植了菌餅的培養皿蓋上，不接觸培養基，置于30℃恒溫培養箱中培養，每天按照十字交叉法測量菌餅直徑，計算生長量和抑菌率[9]，實驗重復3次，取平均值。對照組不添加任何香料，其他操作一致。

1.2.6 單一香料揮發氣氛的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

實驗進行到第5天時，觀察含有香料香氛的培養皿，以菌絲純生長量為0的培養皿中含有的香料最低濃度作為該香料揮發氣氛的最低抑菌濃度(CMIC)。挑取上述菌絲純生長量為0的培養皿中的黑曲霉孢子接種到空白PDA培養基中繼續培養5d后，以完全沒有菌生長的最低濃度作為該香料揮發氣氛的最低殺菌濃度(CMBC)。

1.2.7 香料揮發性香氛的協同抑菌實驗

采用L9(33)正交試驗設計，研究茶樹油、丁香酚和檸檬醛的香料配比對揮發性香氛抑菌性的影響。香料液的復配比例按因素水平表進行，混合后用渦旋振蕩器進行充分混勻，分別取6μL 混合香料液(即0.2μL/cm3)添加到PDA培養皿中，添加方法同1.2.5節。

1.2.8 數據分析和處理

采用方差分析(ANOVA)在5%置信度下比較香料配比對抑菌效果的影響，實驗重復3次，結果用“χ-±s”表示。

2 結果與分析

2.1 不同香料的揮發性香氛對荔枝黑曲霉的抑制作用

圖1 茶樹油濃度對黑曲霉菌絲生長的影響Fig.1 Effect of tea tree oil concentration on the growth of Aspergillus niger

采用菌絲生長速率抑菌率法檢測不同香料的揮發性香氛對黑曲霉菌絲生長的抑菌率。由圖1可知，培養1d后，0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3茶樹油的抑菌率分別為78.7%、88.0%、91.6%、99.1%，表明茶樹油對黑曲霉的抑制有濃度依賴性，濃度越高，初始抑菌率越高；而隨著培養時間延長抑菌率逐漸降低，第5天時，0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3茶樹油的抑菌率分別為20.1%、21.7%、33.7%、34.6%，表明茶樹油揮發性香氛對黑曲霉的抑制效果持續性不長。

圖2 檸檬醛濃度對黑曲霉菌絲生長的影響Fig.2 Effect of citral concentration on the growth of Aspergillus niger

由圖2可知，檸檬醛揮發性香氛對黑曲霉有較好的抑制作用。當檸檬醛濃度為0.1μL/cm3時，第1天對黑曲霉的抑菌率達到100%，第2天開始抑菌率逐漸下降，第5天時為64.8%。0.2μL/cm3的檸檬醛在前2天都可以完全抑制黑曲霉，第3天開始抑菌率緩慢下降，第5天時為89.1%。0.3μL/cm3的檸檬醛在第4天開始未達到對黑曲霉的完全抑制。濃度為0.4μL/cm3時則實驗期間抑菌率均為100%。

圖3 丁香酚濃度對黑曲霉菌絲生長的影響Fig.3 Effect of eugenol concentration on the growth of Aspergillus niger

由圖3可知，丁香酚的揮發性香氛對荔枝黑曲霉的抑菌率在這3種抑菌劑中最高，當丁香酚濃度為0.2μL/cm3時，實驗第4天才觀察記錄到有菌絲的生長，第5天時抑菌率為92.1%；而0.3μL/cm3的丁香酚實驗期間完全抑制黑曲霉的生長。

2.2 不同香料揮發性香氛的CMIC和CMBC分析

實驗對不同香料揮發性香氛抑制黑曲霉的CMIC和CMBC進行檢測和分析。茶樹油在0.1～0.6μL/cm3濃度范圍未檢測到CMIC和CMBC值；丁香酚0.2μL/cm3濃度時在實驗的第4天觀察到菌絲增長。當丁香酚為0.3μL/cm3和0.4μL/cm3濃度時，在實驗期間都沒有菌絲增長；將這兩組菌餅上的孢子接種到PDA培養基中連續培養5d后，發現霉菌孢子均沒有萌發跡象，表明丁香酚的最低抑菌濃度和最低滅菌濃度均為0.3μL/cm3；檸檬醛在本次實驗檢測中CMIC和CMBC均為0.4μL/cm3。

2.3 香料的協同抑菌實驗

利用L9(33)正交表進行試驗設計，探討茶樹油、檸檬醛和丁香酚揮發性香氛的協同抑菌性，因素水平及結果見表1。

表1 正交試驗及其結果分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests

由表1可知，各個香料添加量對抑菌率的影響大小為：茶樹油濃度＞丁香酚濃度＞檸檬醛濃度，最佳配方為A3B2C3，即茶樹油、檸檬醛、丁香酚濃度比為1:1:1。為進一步判斷上述三因素對正交試驗結果的影響是否存在，將正交試驗數據進行方差分析。

由表2可知，當可信度為95%，誤差所在列為因素B(檸檬醛濃度)時，因素A(茶樹油濃度)和因素C(丁香酚濃度)對抑菌率的影響顯著，表明茶樹油和丁香酚的含量對復配香料液的抑菌性起主要作用。

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

對復合香料的最佳配比進行驗證，實驗重復3次，得到的黑曲霉抑菌率分別為97.8%、98.5%、97.7%，其平均值為98.0%，RSD值為0.4%。驗證實驗的結果表明，復合香料中茶樹油、檸檬醛、丁香酚的濃度比為1:1:1時，0.2μL/cm3的揮發性香氛抑制黑曲霉效果明顯，第5天時抑菌率為98%，高于茶樹油、檸檬醛、丁香酚單獨使用時的21.7%、89.1%、92.1%，可見3種香料具有明顯的協同增效作用。

3 結 論

將具有抗菌作用的植物作為抗菌藥物使用已有很長的歷史，部分植物精油的抗菌特性也已被人們所認知。茶樹油是由桃金娘科白千層屬灌木樹種互葉白千層的新鮮枝葉經過水蒸氣蒸餾得到的揮發性芳香精油[14]。近年來對茶樹油的研究表明，茶樹油具有良好的抗真菌[15]活性，溫和無刺激[16]，美國已經批準茶樹油作為食品香料使用，FEMA號為3902[9]。丁香酚和檸檬醛都為單離食用香料，分別分離自常用的食用香料丁香和檸檬草[17]。丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是丁香揮發油中的主要成分，為有機酚類，具有較好的揮發性，可以作用于微生物細胞膜的蛋白質和脂質，對真菌具有較強的抑制作用[18]。檸檬醛是檸檬草揮發油和山蒼子揮發油中的主要成分[19]，有破壞真菌質膜的作用[8]，在食品、醫療衛生領域的應用顯示其對真菌有較好的抑制效果。

本實驗中，茶樹油揮發性香氛在0.1～0.6μL/cm3的濃度范圍內對荔枝黑曲霉的抑菌效果持續性稍差。丁香酚和檸檬醛的揮發性香氛對黑曲霉有較強的抑制和殺滅作用，CMIC分別為0.3μL/cm3和0.4μL/cm，CMBC分別為0.3μL/cm3和0.4μL/cm3。茶樹油與丁香酚和檸檬醛復配后協同抑菌作用顯著增強，且效果持久；當復合香料中茶樹油、檸檬醛、丁香酚的濃度比為1:1:1時，0.2μL/cm3的揮發性香氛抑制黑曲霉效果明顯，第5天時抑菌率為98%，高于相同濃度的茶樹油、檸檬醛、丁香酚單獨使用時抑菌率。

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Inhibitory Effects of Tea Tree Oil, Eugenol and Citral on Aspergillus niger in Litchi

ZHONG Ye-jun1，XU Xin-yuan1，LIU Cheng-mei1,*，SUN Jian2，WU Jian-yong1，LIU Tao-ying1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Institute of Agro-food Science and Technology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)

The inhibitory and synergistic inhibitory effects of volatile aromatic components from tea tree oil, eugenol and citral on rot-causing fungi such as Aspergillus niger in litchi were studied. The results showed that the volatile aromatic components from eugenol and citral had strong inhibitory effect on Aspergillus niger with minimum inhibition concentrations of 0.3 μL/cm3(air volume) and 0.4 μL/cm3(air volume), respectively. The anti-fungal effect of tea tree oil was weak, while its inhibitory effect could be enhanced in the attendance of eugenol and citral.

tea tree oil；eugenol；citral；Aspergillus niger；bacteriostasis

TS201.6

A

1002-6630(2012)11-0021-04

2011-07-04

廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻10100009-2)

鐘業俊(1982—)，男，助理研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：zhongyejun@ncu.edu.cn

*通信作者：劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn