輔酶Q10高產菌株的誘變選育

曹燕妮，岳田利*，袁亞紅，高振鵬

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

輔酶Q10高產菌株的誘變選育

曹燕妮，岳田利*，袁亞紅，高振鵬

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

以豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum 1.1723)為出發菌株，利用紫外-LiCl和超聲波進行誘變，以期獲得高產輔酶Q10菌株。結果表明：1g/L LiCl誘變能顯著提高菌株的正突變率，超聲波誘變會引起細胞壁結構與構成發生改變。通過羅紅霉素初篩和搖床復篩，獲得輔酶Q10突變株C40-05，胞內輔酶Q10產量為1.198mg/g干菌，比出發菌株(0.389mg/g)提高了208%。菌株經5次傳代培養，胞內輔酶Q10產量下降了2.67%，突變株遺傳形狀穩定，可作為輔酶Q10生產菌株。

豌豆根瘤菌；輔酶Q10；紫外-LiCl；超聲波；誘變

輔酶Q10(coenzyme Q10)又稱癸烯醌、泛醌，是脂溶性醌類化合物，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞等生物體內，是電子傳遞的重要組成部分，具有抗氧化、增強免疫力和清除自由基的作用[1]。作為一種重要的生化藥劑，輔酶Q10在臨床醫學中有廣泛的應用，對穩定性心絞痛、肌肉疾病、帕金森癥等疾病有很好的療效[2-4]。研究表明，輔酶Q10的基本保健用量為每日20～30mg，長期高劑量服用輔酶Q10可顯著改善人體的身體健康狀況[5]，對一些疾病有緩解和治療作用，因此輔酶Q10又被稱作營養補增劑[6]。

輔酶Q10生產方法有動植物組織提取法、植物細胞培養法[7]、化學合成法和微生物發酵法，其中微生物發酵法成本低、不受原料限制、易大規模生產、易分離純化、產品活性好[8]，因而成為最有發展前景的生產方法。目前，國內制約微生物發酵法生產輔酶Q10的關鍵在于缺乏優良的輔酶Q10生產菌株。

近年來，紫外與氯化鋰(LiCl)復合誘變被應用于刺糖菌素[9]、1,3-丙二醇[10]、L-組氨酸[11]等高產菌株的選育中，多數都以LiCl作為篩選平板與紫外進行復合誘變。超聲波誘變在乳鏈菌肽[12]、L(+)-乳酸[13]、透明質酸[14]等的高產菌株選育中也有較好的突破。本實驗選擇豌豆根瘤菌為出發菌株，該菌株生物量高、發酵周期短，適合短時間內進行大量的突變株篩選，再對菌株進行紫外-LiCl復合誘變和超聲波誘變處理，結合羅紅霉素抗性篩選，以期獲得輔酶Q10的高產突變株，旨為輔酶Q10的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum 1.1723)，購自中國普通微生物菌種保藏中心。

石油醚、無水乙醇、焦性沒食子酸均為分析純 西安化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV6200紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MCFD5505真空冷凍干燥機 美國SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基

基礎培養基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨5、酵母提取物3、CaCl20.6，pH7.0。

初篩培養基：在基礎培養基中加入羅紅霉素0.09mg/L。

1.3.2 生長曲線的繪制

將活化好的豌豆根瘤菌種子液按2%的接種量接入50mL基礎培養基中，于28℃、180r/min條件下搖床培養，每2h取1次樣，4500r/min離心10min，以每次所得的上清液校正分光光度計的零點，測波長620nm處菌體光密度(OD)值。以時間為橫坐標，OD620nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 紫外- LiCl誘變

1.3.3.1 菌懸液制備與LiCl誘變處理

分別取10mL培養8h的發酵液于4個無菌離心管中，4500r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，沉淀用10mL生理鹽水洗滌離心2次。菌懸液的不同處理方式見表1，其中A組為對照組。

表1 菌懸液的LiCl誘變的不同處理方式Table 1 Different treatment styles for bacterial suspension

1.3.3.2 紫外誘變處理

開啟紫外燈預熱15min，取表1 中4組菌懸液各0.1mL注入基礎培養基平板中，涂布均勻，準備照射。照射需在紅光暗室中進行，照射時間為4、8、12、16、20、24s，以未經照射的平板作為對照，每組3個平行，照射后立即取出，用錫箔紙包好，28℃培養24h。根據所得致死率曲線，對菌株采用致死率為70%～80%的處理時間進行誘變[15]。

將上述處理好的菌懸液做適當稀釋，調整細胞濃度為107～108個/mL。

1.3.3.3 初篩

根據致死率曲線，確定照射時間，吸取0.1mL菌懸液涂布于羅紅霉素篩選平板上，進行紫外照射。

1.3.3.4 復篩

經初篩挑選的突變株，在豌豆根瘤菌種子液中培養16h，按2%的接種量轉入發酵液中，于28℃、180r/min搖床培養24h，離心收集菌體，使用醇堿皂化法[16]測定胞內輔酶Q10含量。

1.3.4 超聲波誘變

1.3.4.1 菌懸液制備

分別取10mL培養8h的發酵液于5個無菌離心管中，4500r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，沉淀用10mL生理鹽水洗滌離心2次。

1.3.4.2 超聲波處理

超聲波工作條件為45kHz、280W、220V，對菌懸液依次誘變10、20、30、40、50min，取誘變后的菌懸液0.1mL涂布于完全培養基平板上，每組3個平行，28℃培養24h。

1.3.4.3 初篩

取超聲波處理20、30、40min的菌懸液各0.1mL，涂布于羅紅霉素篩選平板上，28℃培養24h后，挑選長勢較好的菌落進行復篩。

1.3.4.4 復篩

經初篩挑選的突變株，在種子液中培養16h，按2%的接種量轉入發酵液中，于28℃、180r/min搖床培養24h后，離心收集菌體，使用醇堿皂化法測定胞內輔酶Q10含量。

1.3.4.5 突變株基本生物學特性研究

對超聲波誘變處理獲得的突變株進行革蘭氏染色處理和掃描電鏡觀察。

1.3.4.6 遺傳穩定性

復篩出的突變株利用斜面接種作傳代實驗，傳代5次后，考察輔酶Q10產量的穩定性。

2 結果與分析

2.1 豌豆根瘤菌的生長曲線

由圖1可知，菌株在培養2h時進入對數期，培養16h時進入穩定期。本實驗選取培養8h的發酵液制備菌懸液，調整細胞濃度為107～108個/mL。

圖1 豌豆根瘤菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Rhizobium leguminosarum

2.2 紫外-LiCl復合誘變

2.2.1 LiCl誘變的不同處理方式對菌體的影響

紫外-LiCl復合誘變中，經過LiCl處理后的細胞進行UV處理可能會導致AT-GC堿基對的轉換或者導致堿基的缺失，所以會增強正向突變的幾率[10]，但因為LiCl本身對菌體有毒害作用，高質量濃度的LiCl會抑制菌體生長，因此需研究1g/L LiCl對菌體生長的影響，結果見表2。菌體經4種不同方式處理后培養24h，加入LiCl的實驗組與對照組相比，菌落總數基本一致，菌落大小相近，形態正常，實驗組用LiCl處理細胞對菌體生長沒有顯著影響，因此可以采用1g/L LiCl溶液來配制豌豆根瘤菌懸浮菌體。

表2 LiCl誘變的不同處理條件下菌體的生長狀況Table 2 Effect of LiCl treatment conditions on the growth of Rhizobium leguminosarum

2.2.2 紫外-LiCl誘變的不同處理條件下的豌豆根瘤菌致死率曲線

圖2 紫外-LiCl誘變的不同處理條件下的豌豆根瘤菌致死率曲線Fig.2 Lethality curve of Rhizobium leguminosarum under different LiCl treatment conditions

由圖2可知，紫外照射相同時間下A組和B組之間致死率的變化比較小，但C組和D組的致死率較A組、B組有大幅度提高，表明LiCl在復合誘變中可增加菌體的輻射吸收量，隨著LiCl含量的增加，菌體輻射吸收量隨之增加，最后導致致死率升高。C組、D組懸浮菌體的溶液中LiCl的含量相同，但D組相同照射時間的致死率明顯高于C組，分析D組在對菌體處理的12h中處于勻速振蕩環境，菌體能比較均勻的懸浮于溶液中，充分與溶液接觸，從而使滲入細胞中LiCl含量高于C組，在輻照處理時，增加的輻射量可直接作用于菌體內部，引發菌體變異，導致菌體死亡，從而使得菌體的致死率有了一定的提高。

為了研究1g/L LiCl在紫外誘-LiCl復合變中對正突變率的影響，應選擇兩者致死率相近的輻照時間作為誘變處理時間進行實驗。因此選擇A組照射12s和D組照射8s作為誘變條件。

2.2.3 紫外- LiCl誘變正突變率的比較

取稀釋好的A組、D組菌懸液各1mL，涂于初篩培養基平板上，分別進行紫外輻照處理12s和8s，于28℃條件下培養24h，統計菌落數，挑取單菌落保藏于斜面培養基，再經搖床復篩，測突變株輔酶Q10產量。結果見表3。相同致死率的照射條件下，用1g/L LiCl振蕩處理12h的菌懸液所得的正突變率較高，LiCl在復合誘變中可以增加菌體的輻射吸收量，滲入細胞內部后效果更加明顯，同時在誘導菌體向有利方向突變、提高正突變率方面有一定的貢獻。

表3 紫外- LiCl誘變正突變率比較Table 3 Positive mutation rates of Rhizobium leguminosarum after LiCl treatment followed by UV irradiation

通過羅紅霉素的抗性初篩，以及進一步的發酵復篩，獲得正突變6株，依次編號Z01～Z06，其中菌株Z06產量較高，胞內輔酶Q10含量為0.565mg/g，較出發菌株(0.389mg/g)提高了45.2%。

2.3 超聲波誘變

2.3.1 超聲波誘變的豌豆根瘤菌的致死率曲線

由圖3可知，隨著超聲波處理時間的加長，豌豆根瘤菌致死率相應提高，當超聲波誘變時間為40min時，致死率達到97%。目前對超聲波誘變機理尚不明了，因此對超聲波誘變20、30、40min的正突變率都進行研究。

圖3 超聲波誘變豌豆根瘤菌的致死率曲線Fig.3 Lethality curve of Rhizobium leguminosarum under ultrasonic treatment

2.3.2 超聲波不同誘變時間正突變率的比較

表4 超聲波不同誘變時間正突變率比較Table 4 Positive mutation rates of Rhizobium leguminosarum after ultrasonic treatment for different minutes

超聲波具有很強的生物學效應，其空化作用可產生瞬間高溫和射流等，這足以改變細胞壁和細胞膜的結構，使細胞內外發生物質交換，甚至導致突變[13]。由表4可知，超聲波誘變40min時，該菌正突變率最高，可能是隨著誘變時間的延長，超聲波對細胞的作用加強，增加了突變的可能性，因此選擇40min為超聲波誘變條件。經過篩選共得到5株正突變菌株(編號C40-01～C40-05)，其中C40-05的產量最高，胞內輔酶Q10含量為1.198mg/g，比出發菌株(0.389mg/g)提高了208%。

2.3.3 革蘭氏染色實驗結果

表5 革蘭氏染色結果Table 5 Gram staining results

由表5可知，出發菌株豌豆根瘤菌為革蘭氏陽性菌，呈紫色，得到的10株突變株中4株為革蘭氏陽性菌，6株為革蘭氏陰性菌。結果表明經超聲波誘變所得的一部分突變株的細胞壁結構與構成發生變化，與原始出發菌株有差異，分析與超聲波的空穴作用有關，隨著超聲波誘變時間的增加，這種作用隨之增強，增加了突變發生的幾率。

2.3.4 突變菌株C40-05與原始菌株形態比較

圖4 豌豆根瘤菌1.1723(×3300)Fig.4 Scan electron micrograph of Rhizobium leguminosarum RL1.1723 (× 3300)

圖5 突變株C40-05(×15000)Fig.5 Scan electron micrograph of Rhizobium leguminosarum C40-05 (×15000)

由圖4、5可知，出發菌株豌豆根瘤菌1.1723為桿菌，而突變株C40-05菌體形態接近于橢圓形，與出發菌株相比，其細胞大小有顯著變化。在實驗過程中開通了循環水并加入適量的冰塊，使超聲波誘變時菌液處于25～30℃之間，減少了高溫對菌體的影響，超聲波產生的瞬時高壓和沖擊力，使菌體細胞壁受到影響甚至一定程度破壞，造成了菌體細胞內物質溶出或交換，最終使突變株的細胞形態發生變化。

2.3.5 突變株C40-05的遺傳穩定性

表6 突變株C40-05遺傳穩定性Table 6 Genetic stability of Rhizobium leguminosarum C40-05

由表6可知，突變菌株C40-05經5次傳代培養，胞內輔酶Q10產量維持在1.166～1.195mg/g之間，下降2.67%，表明突變株C40-05的遺傳標記和產輔酶Q10的能力穩定，可用于進一步實驗。

3 結 論

采用紫外-LiCl和超聲波對豌豆根瘤菌進行誘變處理，LiCl質量濃度為1g/L，處理時間為12h，紫外照射時間為8s，超聲波的處理條件為45kHz、280W，處理時間40min，經過平板初篩和搖床發酵復篩，選育出1株輔酶Q10產量比較高的菌株C40-05，其胞內輔酶Q10含量為1.198mg/g，比出發菌株(0.389mg/g)提高了208%。

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Induced Mutation Breeding and Screening of a Coenzyme Q10-Producing Strain

CAO Yan-ni，YUE Tian-li*，YUAN Ya-hong，GAO Zhen-peng
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Rhizobium leguminosarum 1.1723 was mutagenized by means of LiCl treatment followed by UV irradiation or ultrasonic treatment alone to yield coenzyme Q10-producing strains. The results showed that 1 g/L LiCl could obviously increase the positive mutation rate and that ultrasonic treatment could change cell wall structure of Rhizobium leguminosarum. A mutant C40-05 with high productivity of coenzyme Q10 was obtained through preliminary screening with roxithromycin and secondary screening by means of shake flask cultivation. Its coenzyme Q10 yield was up to 1.198 mg/g, which revealed a 208% increase compared with the original stain. Only 2.67% reduction in coenzyme Q10 yield of the mutant was observed after the fifth passage. Therefore, the obtained mutant is a stable strain that deserves to be studied further.

Rhizobium leguminosarum；coenzyme Q10；UV-LiCl；ultrasonic；mutagenesis

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0121-05

2011-06-02

國家自然科學基金項目(31071550)；農業部“948”項目(2011-G8-04)

曹燕妮(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物工程與食品安全控制。E-mail：kuteng8705@163.com

*通信作者：岳田利(1966—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物工程與食品安全控制。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn