酶解蝦殼蛋白制備ACE抑制劑的工藝優化

施旭丹，羅自生*，那地拉·阿合買提江，孫靜靜

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

酶解蝦殼蛋白制備ACE抑制劑的工藝優化

施旭丹，羅自生*，那地拉·阿合買提江，孫靜靜

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

以蝦殼粉為原料，以水解度和ACE抑制率為指標，利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶進行酶解，其中中性蛋白酶和堿性蛋白酶有較高的ACE抑制活性，因此對堿性蛋白酶和中性蛋白酶的工藝條件進一步優化。結果表明：堿性蛋白酶酶解工藝優化條件為：溫度60℃、pH9.5、底物質量濃度2.5g/100mL、加酶量4000U/g、酶解時間2.5h，在此條件下ACE抑制率最高，為67.70%，水解度為69.79%；中性蛋白酶酶解工藝優化條件為：溫度50℃、pH7.0、底物質量濃度2.5g/100mL、加酶量2000U/g、酶解時間2h，在此條件下ACE抑制率最高，為84.04%，水解度為26.76%。提示中性蛋白酶酶解能夠產生更多的ACE抑制肽，是酶解蝦殼蛋白制備ACE抑制肽的較優酶。

蝦殼；中性蛋白酶；堿性蛋白酶；ACE抑制肽；酶解工藝

人體的血壓調節主要是受到血管緊張素源(renin-angiotensin system，RAS)和激肽源(kallikrein kinin system，KKS)這一對拮抗體系控制，當其失衡時將會引起人體血壓的不正常。一方面，在血管緊張素轉換酶(angiotensinⅠconverting enzyme，ACE)作用下，血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)是使血壓升高的主要物質。另一方面，在KKS體系中，ACE可使具有血管舒張作用的緩激肽轉化為沒有活力的緩釋肽。在兩個系統的聯合作用下，人體內血壓升高[1]。因此，抑制ACE活性可以降低人體血壓。目前已有的治療高血壓的藥物，例如卡托普利、依那普利等，雖然具有很好的專一性和降血壓效果，但是長期服用會引發咳嗽、皮膚病、腎功能衰竭等毒副作用。因此尋找安全可靠、毒副作用小的食源性ACE抑制劑成為研究熱點。通過這些年的研究，從鯰魚[2]、毛蝦[3]、杏仁[4]、魔芋粉[5]、雞骨蛋白[6]、乳制品[7]等動植物蛋白中均有制備分離得到ACE抑制肽。

蝦殼是水產工業和居民日常生活中常見的一種固體廢棄物。隨著我國人工養殖蝦、蟹的增加，這些廢棄物數量也越來越多，若不及時處理，很快就腐壞對環境造成污染。蝦殼多被磨成粉，制成附加值較低的動物飼料。其實，蝦殼中含有豐富的甲殼素、鈣等無機物，其蛋白含量更是高達30%～40%，合理利用可以創造出更大的價值。本研究利用幾種蛋白酶酶解蝦殼中蛋白，以水解度和ACE抑制率為指標，優化酶的酶解工藝，為蝦殼為原料開發的生物活性肽類提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明蝦 杭州農貿市場。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶 上海楷洋生物技術有限公司；血管緊張素轉化酶(ACE)、底物Hippuryl-His-Leu 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SHY-2水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市佳美儀器有限公司；UV-1750紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；9073BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；Universal 320r離心機 德國Hettich Zentrifugen公司；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 原料準備

將蝦殼和蝦頭放于烘箱中50℃、12h，取出粉碎，過60目篩。

1.3.2 指標測定

水分測定：采用直接干燥法[8]；脂肪含量測定：采用索氏抽提法[8]；灰分含量測定：采用550℃干法灰化法[8]；蛋白質含量測定：稱取5g粉碎的蝦殼和蝦頭，加入30mL質量分數為4%的NaOH溶液，于95℃水浴浸泡60min，離心分離，濾渣重復上述實驗，合并上清液，用凱氏定氮法測定上清液的蛋白質含量[9]；氨基酸分析：氨基酸專用高效液相色譜法[8]。氨基態氮測定：采用甲醛滴定法[8]。

1.3.3 水解度的計算[8]

式中：V1為NaOH標準溶液的體積/mL；V2為空白消耗的NaOH標準溶液的體積/mL；c為標準NaOH溶液的濃度/(mol/L)；m為蝦殼中蛋白質的質量/g；V為待測溶液體積/mL；hNH2為反應后氨基態氮濃度/(mmol/g)；h0為反應前氨基態氮濃度/(mmol/g)；htot為每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(mmol/g)，蝦殼蛋白htot＝8.073mmol/g。

1.3.4 ACE抑制率測定

參照Cushman等[10]的方法進行改進。以Hippuryl-His-Leu為底物，測定抑制劑對ACE的抑制活性。反應體系包括pH8.3硼酸-硼砂緩沖液、5mmol/L的HHL 50μL以及40μL抑制劑，終體積為140μL。加入ACE酶液啟動反應，于37℃恒溫1h，然后加入1mol/L HCI終止反應。加入1.2mL乙酸乙酯萃取，離心，吸取1mL酯層于100℃干燥1h，加入3mL蒸餾水，于228nm波長處測定吸光度。

式中：A1為ACE與HHL完全反應后的吸光度；A為加入抑制劑和ACE酶的吸光度；A0為加滅活ACE酶的吸光度。

1.3.5 較優酶的選擇

選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別按照表1條件對蝦殼粉進行水解，反應結束后，置于沸水浴中加熱5min滅酶，將酶解液4000r/min，20min離心，取上清液，檢測水解度和ACE抑制率。

表1 4種酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of 4 kinds of proteases

1.3.6 酶解工藝條件的優化

通過上述酶解效果的比較，選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶進行進一步酶解優化。采用單因素試驗、四因素三水平正交試驗對兩種酶酶解工藝進行優化。

2 結果與分析

2.1 蝦殼基本組成成分及蝦殼蛋白氨基酸分析

表2 蝦殼基本組成成分Table 2 Basic composition of shrimp shell

由表2可知，蝦殼中蛋白質含量為41.37%，并且其粗脂肪含量僅為11.59%，蛋白含量較高且脂肪含量低，具備制備ACE抑制肽的基本條件。ACE抑制肽的C端氨基酸是與ACE活性部位結合的關鍵，活性較強的ACE抑制肽的C端氨基酸一般為具有環狀結構的芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)或脯氨酸；N端為長鏈或具有支鏈的疏水性氨基酸(亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)[11]。經檢測發現，蝦殼中6種氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)占總氨基酸含量的25.89%(表3)，可見，蝦殼是制備ACE抑制肽的較好來源。

表3 蝦殼蛋白氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of shrimp shell

2.2 不同酶的酶解效果比較

圖1 不同酶酶解效果比較Fig.1 Comparative effectiveness of 4 kinds of proteases in hydrolyzing shrimp shell

由圖1可知，中性蛋白酶的ACE抑制率最高，為66.32%，水解度為30.97%；堿性蛋白酶的水解度最高，為44.15%，其ACE抑制率為44.21%。中性蛋白酶和堿性蛋白酶來源穩定且成本低，中性蛋白酶反應條件溫和，符合工業用酶要求。姜瞻梅等[12]利用中性蛋白酶酶解牛乳酪蛋白分離制得具有較高活性的ACE抑制肽。堿性蛋白酶用于制備A C E抑制肽的研究較多，如Wijesekara等[13]利用堿性蛋白酶酶解尖嘴魚魚肉制備得具有較高ACE抑制活性短肽；Lin Feng等[14]通過堿性蛋白酶酶解玉米蛋白制得二肽Ala-Tyr。兩種蛋白酶均具有制備高ACE抑制活性肽的能力，因此，選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為優化目標酶。

2.3 中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解時間優化

圖2 中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解時間-水解度曲線Fig.2 Hydrolysis time courses of shrimp shell by neutral protease or alkaline protease

由圖2可知，兩種酶均是在最初酶解的0.5h內水解度大幅度提高，中性蛋白酶在0.5h時水解度達到19.66%，在2h時水解度達到25.52%，之后水解度升高不明顯，2～5h水解度只提高了0.9%；堿性蛋白酶則在0.5h時達到33.75%，2.5h時水解度達到43.66%，之后水解度基本保持一致。

這可能是在最初的0.5h內蛋白質中可斷裂的肽鍵較多，水解度提高快，而隨著時間的推移，酶可作用的肽鍵數目減少，水解速度下降，水解度基本保持不變。很多文獻研究發現，隨著水解度的提高，ACE抑制活性也隨之提高，Theodore等[2]酶解魚肉蛋白時發現水解度為30%時比5%時有更高的ACE抑制活性，Lignitto等[15]研究奶酪發酵時間與ACE抑制活性時得到相類似的結論，6個月發酵的奶酪比未經發酵的奶酪有更高的ACE抑制能力。但是，當水解度達到一定程度后仍繼續酶解，那么ACE抑制能力則有可能下降，這可能是在酶解過程中產生了無抑制活性的小肽或是氨基酸，從而導致ACE抑制能力下降[2]。再從工業化生產、節約能源和時間考慮，最終選擇中性蛋白酶酶解時間為2h，堿性蛋白酶為2.5h。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 溫度對蛋白酶酶解效果的影響

堿性蛋白酶溫度單因素酶解條件：底物質量濃度2g/100mL、酶用量5000U/g、pH9.0、反應時間2.5h，溫度分別選擇40、45、55、65、70℃。中性蛋白酶溫度單因素酶解條件：底物質量濃度2g/100mL、酶用量5000U/g、pH7.0、反應時間2h，溫度分別選擇37、45、5 0、5 5、6 0℃。結果見圖3。

圖3 堿性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)反應溫度對酶解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on shrimp shell hydrolysis by alkaline or neutral proteases

由圖3可知，堿性蛋白酶在65℃條件下有最高水解度，而中性蛋白酶在50℃時有最高水解度。中性蛋白酶在60℃時水解度上升可能是由于溫度的升高促使蛋白質發生水解。

2.4.2 酶用量對蛋白酶酶解效果的影響

堿性蛋白酶確定酶用量的單因素酶解條件：底物質量濃度2g/100mL、pH8.0、溫度55℃、反應時間2.5h，酶用量分別為2500、3500、5000、6500、8000U/g；中性蛋白酶確定酶用量的單因素酶解條件：底物質量濃度2g/100mL、pH7.0、反應時間2h、溫度45℃，酶用量分別為2500、3500、5000、6500、8000U/g。結果見圖4。隨著酶用量的增大，堿性蛋白酶水解度增加，而中性蛋白酶水解度則趨向減小，這可能是由于堿性蛋白酶與底物結合位點較多，當達到3500U/g時基本達到飽和，因此再增加酶用量，水解度升高不多；而中性蛋白酶在2500U/g時已達到飽和，酶用量的增加反而對底物與酶的結合產生影響，因此酶用量升高而水解度下降。因此選擇堿性蛋白酶酶用量為3500U/g，中性蛋白酶酶用量為2500U/g。

圖4 堿性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)酶用量對酶解效果的影響Fig.4 Effect of protease dosage on shrimp shell hydrolysis by alkaline or neutral proteases

2.4.3 底物質量濃度對蛋白酶酶解效果的影響

堿性蛋白酶所需底物質量濃度單因素酶解條件：pH8.0、酶用量5000U/g、溫度55℃、反應時間2.5h，底物質量濃度分別為1、2、3、4、5g/100mL。中性蛋白酶所需底物質量濃度單因素酶解條件：pH7.0、酶用量5000U/g、溫度45℃、反應時間2h，底物質量濃度分別為1、2、3、4、5g/100mL。結果見圖5。

圖5 堿性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)所需底物質量濃度對酶解效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on shrimp shell hydrolysis by alkaline or neutral proteases

由圖5可知，隨著底物質量濃度的增加，水解度慢慢下降。這可能是由于隨著底物質量濃度的增加，水解液濃度變稠，從而一定程度上抑制酶活性。中性蛋白酶和堿性蛋白酶在酶解底物質量濃度為3g/100mL時水解度分別為17.02%和39.91%，仍保持較高水解度，并在該點水解度下降有放緩趨勢，再增加底物質量濃度時水解度下降明顯，為保證一定的酶解產物濃度，兩種酶底物質量濃度均選擇3g/100mL。

2.4.4 pH值對蛋白酶酶解效果的影響

堿性蛋白酶pH值單因素酶解條件：底物質量濃度2g/100mL，酶用量5000U/g、溫度50℃、反應時間2.5h，pH值分別為6.5、7.0、8.0、9.0、10.0，結果見圖6。可知堿性蛋白酶在pH9.0時有最大水解度。考慮到中性蛋白酶的最佳酶解條件在pH7左右，因此直接選擇pH7進行下一步正交試驗。

圖6 堿性蛋白酶pH對酶解效果的影響Fig.6 Effect of hydrolysis pH on shrimp shell hydrolysis by alkaline protease

2.5 正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，采用四因素三水平對中性蛋白酶水解條件進行優化，以水解度和ACE抑制率為評價指標，確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶最佳水解條件。結果見表4。可知中性蛋白酶酶解時影響ACE抑制率活性大小的因素依次為：酶用量＞pH值＞底物質量濃度＞溫度。利用中性蛋白酶酶解最佳反應條件為：溫度50℃、酶用量2000U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH7。

表4 中性蛋白酶酶解條件優化結果及分析Table 4 Orthogonal array design arrangement and results for optimization of shrimp shell hydrolysis by neutral protease

表5 堿性蛋白酶酶解條件優化結果及分析Table 5 Orthogonal array design arrangement and results for optimization of shrimp shell hydrolysis by alkaline protease

通過表5直觀的極差分析結果發現，堿性蛋白酶酶解時影響ACE抑制率大小的因素依次為：pH值＞酶用量＞底物質量濃度＞溫度。利用堿性蛋白酶最佳反應條件為：溫度60℃、酶用量4000U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH9.5。

酶用量對于兩種酶解產物的ACE抑制活性均有較大影響，中性蛋白酶選擇酶用量為2000U/g，可能是因為中性蛋白酶與蛋白質的作用位點較少，因此酶用量較少時可使底物和酶更好的結合，而堿性蛋白酶作用位點較多，酶用量多時可以快速有效水解底物。兩種酶分別酶解時，底物質量濃度均為2.5g/100mL，產生這一結果的原因可能是因為過高的底物質量濃度會導致酶解液黏度增加，影響了蛋白酶的擴散，從而抑制蛋白酶的酶解，影響ACE抑制肽段的產生。張瑞東等[16]在酶解蛋清蛋白時也產生過相同的現象，低底物質量濃度能夠產生較多ACE抑制肽。

利用堿性蛋白酶酶解的水解度9組數據的平均值為57.33%，中性蛋白酶平均值為21.67%；利用堿性蛋白酶酶解產物ACE抑制率平均值為42.83%，中性蛋白酶的為71.01%。可見水解度越高，ACE抑制活性并非越高。產生這種現象的原因一方面可能是隨著水解度的增加產生了無抑制活性的小肽或是氨基酸，另一方面與酶作用位點有關，利用堿性蛋白酶酶解所得產物分子質量分布較為廣泛，而中性蛋白酶所得產物分子質量分布更為集中[17]，可見堿性蛋白酶的酶切位點較多，產生了分子質量大小不一且ACE抑制活性不同的肽段，而中性蛋白酶的酶切位點則較為集中，因此得到較多具有ACE抑制活性的肽段。

2.6 驗證實驗

采用上述優化后的酶解工藝條件，即中性蛋白酶：溫度50℃、酶用量20 00 U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH7、反應時間2h；堿性蛋白酶：溫度60℃、酶用量4000U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH9.5、反應時間2.5h，進行驗證實驗，與正交試驗中ACE抑制率最高組比較。結果發現中性蛋白酶酶解產物的ACE抑制率為84.04%，水解度為26.76%，正交試驗抑制率最高組ACE抑制率為80.50%；堿性蛋白酶酶解產物的ACE抑制率為67.70%，水解度為69.79%，正交試驗抑制率最高組ACE抑制率為65.90%。表明通過正交試驗，酶解產物ACE抑制率得到了一定優化。

3 結 論

3.1 水產類食品來源的ACE抑制肽的研究主要集中在魚類蛋白、貝類蛋白、蝦肉蛋白等，對于水產品的廢棄物的研究很少。通過蝦殼成分測定和氨基酸分析，發現蝦殼是一種高蛋白、低脂肪資源，并且含有較多疏水性氨基酸，是作為制備ACE抑制肽的合適原料。

3.2 通過比較4種蛋白酶酶解蝦殼所得到酶解產物的ACE抑制活性和水解度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物有較高的ACE抑制活性，因此選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解蝦殼蛋白制備ACE抑制肽，進行酶解工藝進一步優化。

3.3 通過單因素試驗和正交試驗，以ACE抑制率為評價指標，確定中性蛋白酶最佳酶解條件為溫度50℃、酶用量2000U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH7、酶解時間2h；堿性蛋白酶最佳酶解條件為溫度60℃、酶用量4000U/g、底物質量濃度2.5g/100mL、pH9.5、酶解時間2.5h。優化酶解工藝后中性蛋白酶和堿性蛋白酶的ACE抑制率分別為84.04%和67.70%。基于以上結果，蝦殼作為制備ACE抑制肽的原料是可行的。

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Enzymatic Preparation of Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Shrimp Shell

SHI Xu-dan，LUO Zi-sheng*，Nadila AHEMAITIJIANG，SUN Jing-jing
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

In order to find the appropriate proteases for enzymatic preparation of angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from shrimp shell, neutral protease, alkaline protease, bromelin and papain were evaluated for their effectiveness in hydrolyzing shrimp shell based on hydrolysis degree and ACE-inhibitory activity. It was found that both neutral protease and alkaline protease were more suitable for the preparation of ACE-inhibitory peptides from shrimp shell. The process conditions for hydrolyzing shrimp shell with neutral protease or alkaline protease were optimized by orthogonal array design method. The optimized alkaline protease hydrolysis conditions were hydrolysis temperature of 60 ℃, hydrolysis pH of 9.5, substrate concentration of 2.5 g/100 mL, enzyme concentration of 4000 U/g and hydrolysis time of 2.5 h, resulting in an ACE-inhibitory rate of 67.70% and a hydrolysis degree of 69.79%. The optimized neutral protease hydrolysis conditions were hydrolysis temperature of 50℃, hydrolysis pH of 7.0, substrate concentration of 2.5 g/100 mL, enzyme concentration of 2000 U/g and hydrolysis time of 2 h, resulting in an ACE-inhibitory rate of 84.04% and a hydrolysis degree of 26.76%. In conclusion, neutral protease is a superior protease over alkaline protease for the preparation of ACE-inhibitory peptides from shrimp shell.

shrimp shell；neutral protease；alkaline protease；ACE inhibitory peptide；enzymatic hydrolysis

TS201.1

A

1002-6630(2012)11-0131-06

2011-05-21

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD29B06)；浙江省重點科技創新團隊項目(2009R50036)

施旭丹(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：flybird_sxd@126.com

﹡通信作者：羅自生(1972—)，男，教授，博士，研究方向為農產品貯藏加工。E-mail：luozisheng@zju.edu.cn