球等鞭金藻胞內和胞外多糖的分離純化及其抑菌活性

孫穎穎，周 豹，徐深圳，李文浩，閻斌倫*

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

球等鞭金藻胞內和胞外多糖的分離純化及其抑菌活性

孫穎穎，周 豹，徐深圳，李文浩，閻斌倫*

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

采用分級沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析和DEAE-52離子交換柱層析對球等鞭金藻胞內粗多糖(IPS)進行分離；對胞外粗多糖(IEPS)則進行Sephadex G-100凝膠柱層析分離。在此基礎上，分析所獲多糖組分對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌等細菌的抑菌活性。同時，通過紫外光譜和紅外光譜測定，比較IPS和IEPS結構的異同。結果表明：IPS和IEPS均具有抑菌活性，前者抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，后者抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長；IPS經DEAE-52纖維素柱層析分離，獲得2個多糖組分：IPSⅠ和IPSⅡ。IEPS經Sephadex G-100凝膠柱層析分離，獲得3個多糖組分：IEPSA、IEPSB和IEPSC。活性檢測表明，IPSⅠ和IPSⅡ抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長；IEPSA、IEPSB和IEPSC抑制大腸桿菌的生長；紫外光譜表明，IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質和色素；IPS和IEPS的紅外光譜比較相似，以半乳糖為構架，均含有酰氨取代基，但不同之處在于，后者不含硫酸取代基。

球等鞭金藻；胞內多糖；胞外多糖；分離純化；抑菌活性

海洋微藻多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射和降血糖等活性功效[1-5]；且由于海洋微藻的生長條件和環境特點決定了其可能具有一些有別于陸生植物多糖的結構和功能，此類多糖在醫藥和醫學領域中的應用潛力越來越引起人們對其的研究興趣。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)是水產養殖業中重要的餌料微藻，以往研究主要集中在脂肪酸上[6-7]。Sukenik[6]、戴俊彪[7]、王長海[8]等實驗發現，球等鞭金藻胞內多糖含量較高。然而，有關球等鞭金藻多糖的分離純化研究較少，且目前尚未見此微藻多糖組分的抑菌活性報道。鑒于此，本實驗從球等鞭金藻的藻細胞和培養液中分別提取胞內和胞外粗多糖。隨后，采用分級沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析、DEAE-52離子交換柱層析以及Sephadex G-100凝膠柱層析等方法對胞內和胞外多糖進行分離。在此基礎上，研究多糖組分的抑菌活性，并利用紫外光譜和紅外光譜分析胞內和胞外粗多糖結構的異同，以期為深入開展海洋微藻多糖的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻由中國海洋大學提供，置于40L光照平板生物反應器中培養，通氣量2.0L/min，溫度(23±2)℃，光照強度3000lx，接種密度40×104mL-1，f/2培養基[9]。培養10d后，離心，保存藻細胞和上清液，分別進行如下處理：藻細胞冷凍干燥，獲得藻粉；上清液經0.45μm微孔濾膜過濾后，低溫冷凍。冷凍干燥后，獲得白色粉末狀的胞外物。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌由華中農業大學農業微生物種質及遺傳資源保藏和利用中心提供。

Sephadex G-75、Sephadex G-100和DEAE-52 美國Sigma公司；乙醇、三氯乙酸(TCA)、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、考馬斯亮藍均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-1800紫外-可見分光光度計 北京瑞麗分析儀器公司；HH-S恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司；LG-5真空冷凍干燥機 上海市離心機械研究所；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 球等鞭金藻胞內和胞外粗多糖的制備

藻粉中按質量比1:20加入蒸餾水，混合均勻后，調pH值為9，70℃浸提3h。提取結束后，6000r/min離心10min。上清液加入3% TCA，4℃靜置3h后，6000r/min離心10min。上清液加入體積分數75%乙醇沉淀12h，經離心及冷凍干燥等處理后，得58g乳白色粉末，即球等鞭金藻胞內粗多糖(Isochrysis galbana polysaccharides，IPS)。

稱取適量球等鞭金藻胞外物質干粉末，以料液比1:20加入蒸餾水溶解，調溶液pH值為10，于80℃提取6 h。提取結束后，提取液經離心、過濾，乙醇沉淀后，制備到24.2g白色粉末，即球等鞭金藻胞外粗多糖(Isochrysis galbana extracellular polysaccharides，IEPS)。

1.3.2 IPS的分離

1.3.2.1 分級沉淀及Sephadex G-75凝膠柱層析分離

稱取5g IPS重新溶解后，依次用5%、50%和75%乙醇進行分級沉淀，獲得3個組分，分別記為IPSA、IPSB和IPSC，質量依次為1.0、2.0、0.44g。所獲組分重新溶解，配制質量濃度為0.05g/L后，將其加載于Sephadex G-75凝膠層析柱(2.3cm×50cm)用蒸餾水進行洗脫，每管收集3mL，流速2.5mL/min，餾分采用硫酸-蒽酮法檢測[10]。多糖組分合并收集后，進行抑菌活性檢測。

1.3.2.2 DEAE-52離子交換柱層析分離

將2.5g/L IPS溶液加載于DEAE-52離子交換層析柱(2.3cm×50cm)，依次用蒸餾水，0.1～0.5mol/L NaCl，0.1、0.5、1.0mol/L NaOH進行洗脫，每管收集3mL，流速為1.5mL/min，以硫酸-蒽酮法檢測多糖，直至檢測不出多糖組分，換用下一種洗脫液。多糖組分合并收集后，進行抑菌活性檢測。其中，用N aC l和NaOH溶液進行洗脫所收集餾分經透析后，進行抑菌活性檢測。

1.3.3 IEPS的Sephadex G-100凝膠柱層析分離

將5g/L IEPS水溶液加入到Sephadex G-100層析柱(2.3cm×50cm)，采用蒸餾水洗脫，每管收集3mL，流速為1.5mL/min，餾分采用硫酸-蒽酮法檢測。

1.3.4 IPS和IEPS的抑菌活性

參照文獻[10]檢測多糖組分對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌4種待測菌株生長的影響，多糖組分質量濃度均為0.05g/L。

1.3.5 多糖測定

用蒸餾水溶解粗多糖，取粗多糖水溶液，用Ultrospec 3300 pro紫外-可見分光光度計在200～800nm范圍內進行光譜掃描。

取適量粗多糖樣品粉末，采用壓片法，用Nexus Euro型紅外光譜儀測定其紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 IPS的分離及抑菌活性

將IPSA、IPSB和IPSC這3個組分重新溶解后，在Sephadex G-75凝膠柱層析上的洗脫曲線見圖1。IPSA未得到明顯的分離；IPSB經分離，在洗脫體積為27～87mL范圍內出現1個峰；IPSC在洗脫體積為24～39mL以及42～87mL范圍內出現2個洗脫峰。

圖1 IPS分級沉淀多糖組分經Sephadex G-75的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of IPSA, IPSB and IPSC on Sephadex G-75 column

IPS經DEAE-52纖維素柱層析分離，共得到2個組分，即蒸餾水洗脫得到組分IPSⅠ，1.0mol/L NaOH洗脫得到組分IPSⅡ。0.1、0.2、0.3、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl以及0.1mol/L和0.5mol/L NaOH洗脫部分未檢測到多糖(圖2)。

圖2 IPS經DEAE-52洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of Isochrysis galbana polysaccharides on DEAE-52 column

圖1 、2表明，IPS經乙醇分級沉淀和Sephadex G-75凝膠柱層析未獲得很好的分離，而采用DEAE-52纖維素柱層析獲得較為理想的分離效果。關于I P S經DEAE-52纖維素柱層析分離獲得的IPSⅠ和IPSⅡ是否為單一組分多糖，還有待進一步實驗研究。

洗脫液多次富集后，將IPSⅠ和IPSⅡ濃縮(IPSⅡ還需透析)，配制為0.05g/L后進行抑菌活性檢測，結果見表1。IPS能抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，但對變形桿菌并無抑制作用。IPSA、IPSB和IPSC組分同樣均能抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，但對大腸桿菌并未表現出抑制作用；胞內粗多糖經DEAE-52離子交換柱層析分離獲得組分IPSⅠ和IPSⅡ，這2個組分能抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

表1 IPS組分的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of intracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

2.2 IEPS的分離及抑菌活性

圖3 IEPS經Sephadex G-100洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of Isochrysis galbana extracellular polysaccharides on Sephadex G-100 column

圖3 為IEPS在Sephadex G-100凝膠柱層析上的洗脫曲線，獲得3個組分，即IEPSA、IEPSB和IEPSC。多次富集后，將IEPSA、IEPSB和IEPSC濃縮，配制為0.05g/L后進行抑菌活性檢測，結果見表2。對IEPS而言，其對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現出抑制作用；當IEPS經Sephadex G-100柱層析分離后，所獲的IEPSA、IEPSB和 IEPSC這3個多糖組分僅能抑制大腸桿菌的生長。

表2 IEPS組分的抑菌作用Table 2 Antibacterial activity of crude extracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

2.3 IPS和IEPS的紫外光譜和紅外光譜

圖4 IPS(a)和IEPS(b)的紫外光譜Fig.4 UV spectra of intracellular and crude extracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

由圖4可知，無論是IPS，還是IEPS，在260nm (核酸特征吸收)、280nm(蛋白質特征吸收)和630nm(色素特征吸收)都沒有吸收，說明IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質和色素。在螺旋藻多糖和糖蛋白提純研究中，胡群寶等[11]運用紫外光譜分析糖蛋白特征。孟慶勇等[12]也采用紫外光譜掃描來分析江蘺多糖是否含有核酸和蛋白質。

圖5 IPS(a)和IEPS(b)的紅外光譜圖的比較Fig.5 IR spectrum comparison between crude extracellular and intracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

由圖5可知，IPS和IEPS的紅外光譜比較相似。3700～3100cm-1和 1075～1010cm-1兩處為糖類O—H 和C—O特征吸收峰；在3000～2800cm-1和1550～1200cm-1的吸收峰為C—H伸縮振動和變角振動；1700～1500cm-1附近的吸收峰為C＝O伸縮振動，表明這兩種多糖中均含有酰氨取代基，這與孟慶勇[13]、張塞金[14]等研究結果相符。兩種粗多糖都在1057cm-1附近有吸收峰，表明是一種以半乳糖為構架的分子模式。此外，在糖類環振動吸收區930～700cm-1，兩種糖在900cm-1附近均有一個很微弱的吸收峰，是β-吡喃環C—H變角振動。IPS在1377cm-1附近有較強吸收峰，IEPS紅外光譜圖未見吸收峰，這表明IPS含有硫酸取代基，IEPS不含硫酸取代基。

3 討 論

在微藻抗菌研究中，多數研究集中在微藻脂肪酸的抑菌活性方面[15-20]，而有關微藻多糖抑菌活性的研究則相對較少。目前，已經發現紫球藻和海水小球藻的多糖提取物對革蘭氏陽性細菌有抑制作用[21]。本研究發現IPS和IEPS也具有抑菌活性，前者抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，后者抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長。

為了獲悉球等鞭金藻粗多糖的抑菌機理，對IPS和IEPS進行了分離。IPS經DEAE-52纖維素柱層析分離，獲得2個多糖組分：IPSⅠ和IPSⅡ；IPES經Sephadex G-100凝膠柱層析分離，獲得3個多糖組分：IEPSA、IEPSB和IEPSC。活性檢測表明，IPSⅠ和IPSⅡ抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長；I E P S A、IEPSB和IEPSC抑制大腸桿菌的生長。通過一系列分離，發現多糖分離組分的抑菌活性有所改變(主要是抑菌活性的目標菌株有所減少)，但仍具有抑菌活性，且抑菌活性與粗多糖相當，這個結果對于進行多糖的進一步純化研究具有重要意義。

同時，比較發現IPS和IEPS的抑菌活性有所不同，筆者認為這與它們的結構有關。通過紅外光譜測定，發現IPS和IEPS結構類似，以半乳糖為構架，均含有酰氨取代基，但不同之處在于，后者不含硫酸取代基，這很可能是二者抑菌活性差異的主要原因。張塞金等[14]認為IPS不含硫酸取代基，與本結果不同。已有研究表明，微藻多糖的生物活性和生理功能主要來自于其所含的氨基和硫酸官能團[22-23]，因此，相比而言，IPS可能更具有應用價值。紫外光譜表明，IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質和色素，這就排除了由微藻蛋白質組分可能引起的抑菌作用。

參考文獻：

[1]HAYSAHI T, HAYSAHI K, MAEDA M, et al. Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-green alga Spirulina platensis[J]. Natural Product, 1996, 59(1): 83-87.

[2]HAYSAHI K, HAYSAHI T, KOJIMA L. A natural sulfated polysaccharide, calcium spirulan, isolation from Spirulina platensis: in vitro and in vivo evaluation of anti-herps simplex virus and anti-human immunodeficiency virus activities[J]. AIDS Res Hum Retr, 1996, 12(15): 1463-1471．

[3]顧寧琰, 劉宇峰. 紫球藻胞外多糖抗輻射的生物學活性研究[J]. 海洋科學, 2002, 26(12): 53-56．

[4]劉艷, 楊海波, 趙蓮華, 等. 扁藻多糖的分離分析及其生物活性的初步研究[J]. 生物技術, 2007(3): 53-56.

[5]MINKOVA J. Antiviral activity of porphyridium cruenturn polysaccharide [J]. Pharmazie, 1996, 51(3): 194-199.

[6]SUKENIK A, WAHNON R. Biochemical quality of marine unicellular algae with special emphasis on lipid composition(Ⅰ): Isochrysis galbana [J]. Aquaculture, 1991, 97(1): 61-72.

[7]戴俊彪, 吳余慶. 室內外培養海洋單細胞微藻的生長及生化組分[J].海洋科學, 2000, 24(6): 29-32.

[8]王長海, 孫穎穎. 營養鹽對球等鞭金藻生長及多糖等生化成分含量的影響[J]. 食品與發酵工業, 2005, 31(11): 13-17.

[9]ILLARD R R L, RYTHE J H. Studies of marine planktonic diatom.Ⅰ. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (cleve) Gran.[J]. Canada Journal of Microbio, 1962, 8: 229-238.

[10]沈萍, 陳向東. 微生物學實驗[M]. 4版. 北京: 高等教育出版社, 2007: 16-17.

[11]胡群寶, 郭寶江. 螺旋藻多糖和糖蛋白的提純及其理特性研究[J]. 海洋科學, 2001, 25(7): 41-44.

[12]孟慶勇, 王亞飛, 揭新明, 等. 粗江蘺多糖的提取及光譜分析[J]. 光譜學與光譜分析, 2006, 26(10): 1903-1906.

[13]孟慶勇, 劉志輝, 徐美奕, 等. 半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J]. 光譜學與光譜分析, 2004, 24(12): 1560-1562.

[14]張賽金, 李文權, 鄧永智, 等. 海洋微藻多糖的紅外光譜分析初探[J].廈門大學學報: 自然科學版, 2005, 44(B06): 212-214.

[15]CANNELL R J P, MWSIANKA A, WALKER J M. Results of a largescale screening programme to detect antibacterial activity from freshwater algae[J]. Br Phyco1 J, 1988, 23: 41-44．

[16]KELLAM S J, WALKER J M. Antibacterial activity from marine microalgae in laboratory culture[J]. Br Phycal J, 1989, 24: 19l-194．

[17]江紅霞, 鄭怡, 林雄平. 蛋白核小球藻脂溶性化合物的抑菌活性及成分分析[J]. 植物資源與環境學報, 2003, 12(1): 1-5.

[18]李俠, 鄭法新, 程璐. 6種海洋微藻提取物抑菌活性研究[J]. 德州學院學報, 2007, 23(6): 61-64.

[19]姚領. 海洋微藻抗菌活性藻株篩選及其活性物質分離純化研究[D].天津: 天津商業大學, 2007.

[20]王芹. 微藻抗菌活性物質的分離純化[D]. 大連: 大連理工大學, 2009.

[21]陳曉清, 鄭怡, 林雄平. 二種微藻多糖與蛋白質提取物的抗菌活性[J]. 福建師范大學學報: 自然科學版, 2005, 21(2): 76-79.

[22]張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 杭州: 浙江大學出版社, 2003: 193-198.

[23]劉艷, 楊海波, 于媛, 等. 兩種微藻多糖的性質及結構特征的研究[J].水產科學, 2008, 27(3): 125-128.

Separation and Purification of Intracellular and Extracellular Polysaccharides from Isochrysis galbana and Their Antimicrobial Activity

SUN Ying-ying，ZHOU Bao，XU Shen-zhen，LI Wen-hao，YAN Bin-lun*
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Two crude polysaccharides, intracellular polysaccharide (IPS) and extracellular polysaccharide (EPS), were isolated from the cells and culture supernatant of Isochrysis galbana through hot-water extraction. The separation and purification of IPS and EPS, and their antimicrobial activities against Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Proteus sp. were investigate, respectively. IPS was separated by ethanol-precipitation and purified by Sephadex G-75 gel chromatography, or by DEAE-52 column chromatography, while EPS was fractionated by Sephadex G-100 gel filtration chromatography. Finally, IPS and EPS were analyzed by UV and IR spectroscopy. The results indicated that: 1) IPS could inhibit the growth of Escherichia coli, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. EPS could inhibit the growth of Escherichia coli and Bacillus subtilis. 2) IPS was separated into two fractions (IPS Ⅰand IPS Ⅱ) by DEAE-52 column chromatography. Both fractions could inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus; EPS was separated by Sephadex G-100 gel filtration chromatography into three fractions (EPSA, EPSB and EPSC) with inhibitory activity against the growth of Escherichia coli; 3) The IR and UV spectra of IPS and EPS showed no ester protein, nucleic acid or pigment. Typical absorption curves of IPS and EPS revealed galactose frame with pyranglycoside linkage, while EPS did not exhibit sulfate radicals in the sugar linkage.

Isochrysis galbana；intracellular polysaccharide；extracellular polysaccharide separation and purification；antibacterial activity

Q949.6

A

1002-6630(2012)11-0137-05

2011-05-12

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2006BAD09A01)；連云港市工業攻關科技計劃項目(CG0803-1)；淮海工學院人才引進科研啟動基金項目(KQ08001)

孫穎穎(1978—)，女，副教授，博士，研究方向為海洋生化工程。E-mail：syy-999@163.com

*通信作者：閻斌倫(1962—)，男，教授，博士，研究方向為蝦蟹類增養殖學。E-mail：yanbinlun@yahoo.com.cn