轉化白藜蘆醇苷虎杖內生真菌的分離和鑒定

劉華金，易有金,*，楊建奎，鐘英麗，陳 雪

(1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南農業大學理學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

轉化白藜蘆醇苷虎杖內生真菌的分離和鑒定

劉華金1,2，易有金1,2,*，楊建奎3，鐘英麗4，陳 雪1,2

(1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南農業大學理學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

為提高虎杖中白藜蘆醇得率，采用虎杖內生真菌直接發酵虎杖轉化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，通過從虎杖根、莖中初篩得到6株內生真菌，復篩以虎杖煮提液為底物發酵，采用高效液相色譜法定量檢測發酵液中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量。結果表明：6株內生真菌均具有轉化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇能力，其中分離于莖內的J1轉化率最高為25.6%。J1經形態學觀察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鑒定為草酸青霉Penicillium oχalicum，Genbank登錄號為HQ732137。

虎杖；白藜蘆醇苷；白藜蘆醇；內生真菌；分離；鑒定

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)中白黎蘆醇(resveratrol，RES)是一種天然活性多酚化合物，具有抑制腫瘤[1]、保護心血管[2]、抗氧化、抗自由基等作用，它已被列為抗心血管病、抗癌最有前途的藥物之一[3-4]，是繼紫杉醇之后又一綠色抗癌物質。虎杖中白藜蘆醇往往以白藜蘆醇苷(polydatin，PD)的形式存在，干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量僅為0.2%左右，而白藜蘆醇苷含量可達2%[5]。

目前采取化學方法直接從虎杖中提取白藜蘆醇費時、費力且浪費資源，而有機合成白藜蘆醇反應產率低，合成中所用催化劑和反應劑均有一定環境危害性，微生物轉化法能克服以上方法不足，且反應條件溫和、無污染，微生物轉化虎杖已成為生產天然白藜蘆醇研究趨勢之一，如龔云杰等[6]報道從發酵食品分離一株黑曲霉菌固體堆積發酵虎杖根莖，袁潤蕾等[7]報道從自然界分離一株根霉菌對白藜蘆醇苷粗提物進行液態發酵，雖均可提高虎杖白藜蘆醇得率，但菌種篩選過程有一定盲目性。植物內生真菌因其生境獨特，相對于其他微生物資源在微生物轉化領域更具目的性和選擇性[8-9]，至今國內外關于虎杖內生真菌對白藜蘆醇苷進行轉化未見報道；國內有關于從虎杖組織中分離內生真菌B-39[10]、Fusarium verticillioides[11]，因其不以虎杖為發酵底物，直接生產白藜蘆醇，故白藜蘆醇產量較低。本研究擬從新鮮虎杖組織中分離內生真菌，篩選直接以虎杖煮提液為底物，轉化其白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的優良內生真菌，為今后內生真菌直接轉化生產白藜蘆醇提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生虎杖采自湖南省漣源市田心坪村；虎杖飲片購自長沙藥材市場。

白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標準品 中國食品藥品檢定研究所；甲醇(色譜級) 國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 培養基

菌種篩選培養基[12]：初篩培養基：MgSO40.5g、NaNO35g、FeSO40.01g、KH2PO41g、瓊脂18g，加10g/100mL虎杖煮提液至1L，pH值自然；復篩培養基：10g/100mL虎杖煮提液，pH值自然。

菌落培養培養基[13]：查氏酵母膏瓊脂培養基(CYA)、麥芽汁瓊脂培養基(M EA)、甘油硝酸鹽瓊脂培養基(G25N)、察氏培養基(CA)和馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)。

1.3 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、VWD檢測器、Chemistation System工作站) 美國Agilent公司；生化培養箱 北京中興偉業儀器有限公司；高速冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；PCR儀 杭州博日科技有限公司；電泳儀 北京六一儀器廠；Gel Logic 212型凝膠成像系統 美國柯達公司。

1.4 具有轉化能力虎杖內生真菌初篩

采集野生虎杖植株取根、莖桿，表面消毒方法參照文獻[14]，去除根、莖桿韌皮部，取木質部用無菌剪刀剪成0.5cm×0.5cm小塊，無菌水沖洗3～4次，于無菌研缽中研磨成漿液。研磨液以無菌水稀釋10倍后，取0.1mL于初篩培養基上常規涂布，28℃培養72～120h，挑選不同形態菌落于PDA平板劃線純化后，保存備用。

1.5 內生真菌轉化白藜蘆醇苷HPLC檢測

將初篩菌種接入復篩培養基(10g/100mL虎杖煮提液)中進行發酵，28℃、180r/min培養96h，發酵液10000r/min離心10min后，取上清液100μL甲醇稀釋至1mL，混勻，0.45μm微膜過濾后，即為供試品溶液，HPLC檢測發酵液中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量，按下式計算白藜蘆醇苷轉化率，篩選轉化力最強菌株進行鑒定。

1.5.1 色譜條件

色譜柱ODS-C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水(體積比40:60)，流速0.6mL/min，檢測波長306nm，柱溫25℃，進樣量10μL。

1.5.2 標準曲線繪制

分別稱取白藜蘆醇苷和白藜蘆醇標準品各5mg，甲醇溶解定容至25mL，配制成0.2mg/mL白藜蘆醇苷、白藜蘆醇儲備液，備用。分別取儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，用甲醇稀釋至10mL，配制成不同質量濃度標準溶液。按色譜條件進樣，繪制標準曲線。

1.5.3 方法學考察

重復性考察：稱取發酵液分別制備5份供試品溶液，測定峰面積，計算相對標準偏差(RSD)；精密度考察：稱取質量濃度為40μg/mL標準溶液液，重復進樣5次，測定峰面積，計算RSD；穩定性考察：稱取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、1 0、1 2、14、16h內進樣測定峰面積，計算RSD；加樣回收率考察：稱取已知白藜蘆醇苷、白藜蘆醇含量發酵液5份，按其含量30%、60%、90%、120%、150%分別加入白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標準品，按供試品方法制備，測定白藜蘆醇苷、白藜蘆醇峰面積，計算加樣回收率。

1.6 轉化力最強菌株鑒定

1.6.1 形態學鑒定

采用點植法[15]分別接種于CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養基平板中心，25℃培養，觀察記錄各培養基中菌落形態與生長情況。采用插片培養法[15]，經乳酸-棉蘭染液染色后，于光學顯微鏡下觀察記錄菌絲體及孢子形態特征。

1.6.2 分子生物學鑒定

1.6.2.1 菌株基因組DNA提取

隨機取2管菌絲體，參照Weiland[16]所述方法提取基因組DNA，等量混合組成菌株基因組DNA樣品，備用。

1.6.2.2 ITS-5.8S rDNA序列PCR擴增

引物ITS 1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS 4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇(由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。PCR反應體系(50μL)：10×擴增緩沖液5μL、10μmol/L dNTP 2μL、10μmol/L引物ITS 1 2μL、10μmol/L ITS 4 2μL、1U/μL Taq酶1μL、ddH2O 28μL、模板DNA 4μL。循環條件：94℃預變性5min，94℃變性40s，55℃復性35s，72℃延伸40s，以上參數循環30次；最后以72℃終延伸10min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6.2.3 PCR產物序列分析

將序列提交GenBank數據庫，通過Blast(www.nebi. nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源搜索，尋找與目的序列同源性最高的已知分類地位的菌種。

1.6.2.4 系統發育分析和系統發育樹構建

從GenBank中索取與內生菌株J1同源性高的相似菌株的ITS-5.8S rDNA序列，用MEGA4軟件進行序列分析比對，繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 具有轉化白藜蘆醇苷能力虎杖內生真菌初篩

從新鮮虎杖初篩得到6株內生真菌，依次命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6，其中J1～J3分離于莖內，J4～J6分離于根內。

2.2 內生真菌轉化白藜蘆醇苷HPLC檢測

2.2.1 標準曲線繪制

質量濃度為40μg/mL的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標樣HPLC色譜圖見圖1、2，白藜蘆醇苷、白藜蘆醇線性回歸方程分別為Y＝133.4412X＋35.6686(r＝0.9996)、Y＝224.1187X＋138.2686(r＝0.9995)，其中，X為質量濃度/(μg/mL)，Y為峰面積，兩者均在20～100μg/mL范圍內呈良好線性關系。

圖1 白藜蘆醇苷標樣HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard polydatin sample

圖2 白藜蘆醇標樣HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of standard resveratrol sample

2.2.2 方法學考察

重復性：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為0.92%、0.68%，表明該方法重復性好；精密度：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為0.85%、0.75%，表明該方法精密度高；穩定性：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為1.15%、1.21%，表明供試品溶液在16h內穩定；加樣回收：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的平均加樣回收率分別為95.2%、98.9%，RSD分別為1.03%、1.42%，表明該方法回收率較高，偏差較小，準確度較高。

2.2.3 白藜蘆醇苷、白藜蘆醇含量檢測

取初篩內生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6發酵液按上述供試品制備方法制備供試品溶液，按上述HPLC色譜條件進樣平行3次。根據峰面積計算發酵液中白藜蘆醇苷轉化率，結果見表1，內生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6菌株對白藜蘆醇苷的轉化率分別為25.6%、3.5%、15.5%、2.1%、5.6%、8.4%，表明6株初篩菌株均對白藜蘆醇苷有不同程度轉化能力，其中J1轉化率最高。

表1 內生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6對白藜蘆醇苷轉化能力HPLC檢測結果Table 1 Transformation rates of polydatin by endophytic fungi J1, J2, J3, J4, J5, J6 as determined by HPLC

圖3 J1發酵前培養液HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of hot water extract from Rhizoma Polygoni cuspidati

圖4 內生真菌J1發酵96h后發酵液HPLC圖Fig.4HPLC chromatogram of hot water extract from Rhizoma Polygoni cuspidati fermented by stain J1 for 96 h

由圖3、4可知，虎杖煮提液經內生真菌J1發酵后，白藜蘆醇苷(保留時間5.07min)的吸收峰面積明顯減小，白藜蘆醇(保留時間11.094min)的吸收峰面積明顯增加，說明內生真菌J1能有效轉化虎杖煮提液中白藜蘆醇苷為目標物白藜蘆醇。

2.3 內生真菌J1的形態學鑒定

內生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養基上培養7d后菌落形態見表2。

表2 內生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養基上培養7d后菌落形態特征Table 2 Morphological characteristics of strain J1 colonies after incubation on CYA, MEA, G25N, CA, PDA culture media for 7 days

圖5 內生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養基上的菌落形態Fig.5 Morphological observations of strain J1 on CYA, MEA, G25N, CA, PDA culture media

圖6 內生真菌J1菌絲的顯微形態(×100)Fig.6 Mycelium microstructure of strain J1 (×100)

由圖5～6可知，光學顯微鏡下觀察J1菌絲細長、交織分布，有隔膜，分生孢子梗光滑，帚狀枝單輪生或雙輪生，小梗 4～6個輪生，分生孢子鏈狀分布，圓形。鑒定表明內生真菌J1菌落、菌絲和分生孢子形態特征與《常用及常見真菌》及《真菌鑒定手冊》青霉屬草酸青霉(Penicillium oχalicum)基本相符，初步鑒定內生真菌J1為青霉屬草酸青霉(Penicillium oχalicum)。

2.4 內生真菌J1分子生物學鑒定

2.4.1 內生真菌J1基因組DNA提取與ITS-5.8S rDNA擴增

圖7 內生真菌J1 DNA電泳圖Fig.7 Electrophoresis of genomic DNA of strain J1

圖8 內生真菌J1 ITS-5.8S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.8 Electrophoresis of PCR amplified products from ITS-5.8S rDNA of strain J1

提取J1菌株基因組DNA，經電泳檢測得到特異性條帶，如圖7所示，表明內生真菌J1基因組DNA提取成功。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到約600bp的PCR擴增產物，電泳圖譜見圖8，這與以往ITS-5.8S rDNA在所有真菌中都高度保守且長度恒定(約600bp)的報道相吻合[17]，表明內生真菌J1 ITS-5.8S rDNA片段成功擴增。

2.4.2 內生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列分析

實驗測得內生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列全長571bp，該序列在GenBank數據庫登錄號為HQ732137。將序列輸入生物技術信息網頁(http://www.nebi.nlm.nih. gov/BLAST)進行同源性比對，結果表明：內生真菌J1與草酸青霉Penicillium oχalicum (FJ977097.1)同源性最高，相似性為9 9%。

2.4.3 系統發育分析和系統發育樹的構建

圖9 內生真菌J1和相關菌株的系統發育樹Fig. 9 Phylogenetic tree of strain J1 and other related strains

在GenBank中索取與內生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列同源性高的相似菌株13株，用MEGA4軟件進行序列分析，采用N-J法繪制系統發育樹。由圖9可知，內生菌株J1與Penicillium屬的青霉菌處于一個大的分支內，與草酸青霉Penicillium oχalicum (FJ977097.1)處于同一分支，進化距離最近。結合菌落形態和個體顯微形態特征結果，確定內生菌株J1為草酸青霉Penicillium oχalicum。

3 討 論

本研究從野生虎杖莖中初篩得到6株內生真菌，HPLC法檢測表明：6株內生真菌均具有轉化白藜蘆醇苷能力，其中J1轉化力最強，轉化后發酵液中白藜蘆醇含量達14.0675μg/mL，為未發酵前的2.65倍。劉蕓等[11]報道不以虎杖為發酵底物，直接采用內生真菌擬輪枝鐮孢霉Fusarium verticillioides生產白藜蘆醇，發酵液白藜蘆醇含量(1.528μg/mL)遠低于本研究結果。通過對內生真菌J1在上述5種不同培養基上菌落形態觀察和菌絲、分生孢子等顯微觀察，并結合對ITS-5.8S rDNA序列與Genbank中的rDNA同源序列的比對分析，鑒定內生真菌J1為草酸青霉Penicillium oχalicum，GenBank登錄號為HQ732137。具有特定生活史的植物內生真菌與宿主互惠共利協同進化，選擇內生真菌對中草藥進行發酵轉化有其天然協調性，但目前，關于虎杖內生真菌的微生物轉化未見報道。本研究從新鮮虎杖莖中分離內生真菌J1直接作用于虎杖煮提液，不需添加其他成分，有效轉化虎杖中白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，這與鄧志匯等[9]從茶樹根際分離內生毛霉菌轉化簡單兒茶素為酯型兒茶素的研究方法相似，充分證明利用植物內生真菌發酵轉化與植物所產相同或相似的生理活性物質可行，比直接化學提取法[18]原材料利用率高，與有機合成法[19]相比，反應條件溫和，發酵條件簡單、易控制，環境污染小。但分離得到的內生真菌J1為野生型菌株，目前轉化率最高為25.6%，需要通過誘變育種、發酵條件優化等提高其轉化率，為進一步微生物發酵提高虎杖中白藜蘆醇得率提供技術支持。

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi Capable of Transforming Polydatin from Polygonum cuspidatum

LIU Hua-jin1,2，YI You-jin1,2,*，YANG Jian-kui3，ZHONG Ying-li4，CHEN Xue1,2
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China ；2. Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China ；3. College of Sciences, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China ；4. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China )

In order to improve the yield of resveratrol from Polygonum cuspidatum through endophytic fungi transformation, endophytic fungal strains capable of transforming polydatin from Polygonum cuspidatum were screened. The contents of resveratrol and polydatin were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The results indicated that 6 endophytic fungal strains capable of transforming polydatin from Polygonum cuspidatum were identified. Strain J1 had the highest transformation rate, 25.6%. The strain J1 was identified as Penicillium oχalicum with Genbank accession number of HQ732137 through morphologic observation and ITS-5.8S rDNA sequence analysis.

Polygonum cuspidatum；polydatin；resveratrol；endophytic fungi；isolation；identification

Q939.9

A

1002-6630(2012)11-0172-05

2011-07-31

湖南省博士后科研資助專項計劃項目(2010RS4003)；長沙市科技局一般項目(K1005013-31)；湖南省中醫藥科研計劃項目(2010079)

劉華金(1989—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發與利用。E-mail：lhjdyx117@163.com

*通信作者：易有金(1968—)，女，教授，博士，研究方向為微生物資源開發與利用及食品營養。E-mail：yiyoujin@163.com