產寬譜pH細菌素乳酸菌的篩選鑒定、毒力檢測及細菌素特性研究

周 佳，劉書亮*，胡欣潔，張元娥

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

產寬譜pH細菌素乳酸菌的篩選鑒定、毒力檢測及細菌素特性研究

周 佳，劉書亮*，胡欣潔，張元娥

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

采用瓊脂擴散法從分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌中篩選細菌素產生菌，初篩檢測發酵上清液抑菌活性，復篩排除有機酸和H2O2干擾，檢測蛋白酶敏感性，測定抑菌物質鹽析液和粗提液抑菌活性，確定菌株SAU-2為細菌素產生菌。根據形態、生理生化指標和16S rDNA序列系統發育分析，將其鑒定為Enterococcus。腸球菌SAU-2溶血素表型陰性，agg、gelE、cylM、cylB、cylA、esp、efaAfm、cpd、cob、ccf、cyILL、cyILS、fsrB和hyLEfm等毒力因子基因型陰性，表明腸球菌SAU-2是安全的。所產細菌素可耐受121℃條件20min；在pH2.0～12.0有抑菌活性；對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，對木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感；主要對近緣乳酸菌和G+細菌有抑菌活性，除對1株銅綠假單胞菌和1株紅酵母有抑菌活性外，對其余G-細菌和真菌無抑制作用。

奶渣；腸球菌；細菌素；毒力因子；特性

乳酸菌素是“公認安全(GRAS)”的乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類有抑菌活性的多肽或前體多肽，其不僅對親緣關系較近的乳酸菌產生抑制，還對其他G+菌有一定抑制作用[1]。因其具有安全、高效、無殘留、無毒副作用和無耐藥性等特點，引發了研究熱潮。迄今已逾百種乳酸菌素被發現[2]，但廣泛應用的乳酸菌素僅有Nisin。而Nisin只在酸性條件下才有抑菌活性，嚴重限制了它的應用。因此，開發高效、廣譜、穩定性良好的乳酸菌素具有重要意義。

產細菌素乳酸菌的來源廣泛[3-10]，但對我國藏區和內蒙古地區日常生活的必備食品——奶渣中乳酸菌產細菌素的研究尚鮮見報道。目前，對奶渣的研究還很缺乏。對奶渣中微生物的研究只停留在分離鑒定酥油奶渣中的乳桿菌[11]。本研究以分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌為實驗材料，篩選產耐酸堿性細菌素的乳酸菌，并進行鑒定；檢測該菌株的溶血素表型和毒力因子基因型；研究細菌素的生物學特性。這不僅可為深入研究細菌素提供基礎材料，還可為其作為天然食品保鮮劑提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株：分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌；指示菌：藤黃微球菌(Micrococcus luteus)10209；抑菌譜測試菌：9株G+細菌(4株金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌、熱死環絲菌、單核細胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金桿菌各1株)，13株G-細菌(2株假單胞菌、7株沙門氏菌、2株大腸桿菌、沙雷氏菌和發根農桿菌各1株)、7株乳酸菌(2株戊糖乳桿菌、2株植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌各1株)，2株酵母菌(紅酵母和啤酒酵母各1株)和5株霉菌(2株米曲霉及黑曲霉、青霉和毛霉各1株)，均由四川農業大學食品微生物實驗室保存。

1.2 培養基與試劑

MRS培養基用于乳酸菌培養和發酵液制備；H2S實驗、V-P實驗、動力實驗、馬尿酸鹽水解實驗、精氨酸產氨實驗、精氨酸雙水解酶實驗、糖(醇)發酵實驗等培養基用于乳酸菌鑒定；營養瓊脂培養基用于一般細菌培養；PDA培養基用于真菌培養。

胰蛋白酶(250U/mg) 美國Amersco公司；木瓜蛋白酶(6000U/mg)、胃蛋白酶(3000U/mg) 美國Sigma公司；蛋白酶K 德國Merck公司；Bacteria DNA out抽提試劑盒 四川省綿陽天澤基因工程有限公司；R10T1M PCR反應試劑、DL2000 DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖 英國Oxoid公司；脫纖維羊血成都奧克公司。

1.3 引物

細菌鑒定通用引物：正向引物5＇-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇、反向引物5＇-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3＇。擴增的腸球菌毒力基因分別為agg(聚合物)、gelE(編碼明膠酶)、cylM(溶血素的轉錄后修飾)、cylB(溶血素的運輸)、cylA(溶血素的激活)、esp(腸球菌表面蛋白)、efaAfm(屎腸球菌在血清中的細胞壁黏附素表達)、cpd(性信息素)、cob(性信息素)、ccf(性信息素)、cyILL(溶血素前體)、cyILS(溶血素前體)、fsrB(毒力因子調節)和hyLEfm(透明質酸酶)，其擴增引物見表1。以上引物均由上海英俊生物技術有限公司合成。

表1 腸球菌毒力因子擴增引物Table 1 Primers used for virulence factors detection

1.4 儀器與設備

TE412-L精密電子天平、PB-2B pH計 德國Sartorius公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；B4i-BR4i冷凍離心機 美國Thermo公司；1kD透析袋 上海Green Bird公司；游標卡尺 成都量具刃具總廠樂興商貿公司；HJ-3型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；顯微鏡 日本Olympus公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.5 方法

1.5.1 乳酸菌發酵上清液的制備

將待測乳酸菌的18h種齡種子液以5%接種量接入MRS肉湯，30℃靜置培養36h，離心收集上清，待用。

1.5.2 產細菌素菌株的篩選

初篩采用打孔法檢測發酵上清液活性(指示菌終濃度為106CFU/mL)。復篩排除有機酸(調pH值至6.0)和H2O2干擾，檢測蛋白酶敏感性，具體操作參見文獻[17]。采用牛津杯雙層瓊脂法檢測鹽析液(硫酸銨沉淀)和粗提液(透析濃縮處理)抑菌活性。鹽析液和粗提液的制備參見文獻[18]，其中所用緩沖液為20mmol/L檸檬酸-磷酸鈉緩沖液(pH6.0)。

1.5.3 產細菌素乳酸菌的鑒定

1.5.3.1 菌體形態和生理生化實驗

MRS瓊脂平板上觀察菌落形態；革蘭氏染色后觀察菌體形態；各項生理生化實驗參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[19]。

1.5.3.216 S rDNA序列分析

以基因組DNA為模板，PCR擴增待測菌的16S rDNA片段。PCR反應體系：10μmol/L上下游引物各1μL、模板DNA 1μL、2.5U/mL Taq酶 0.5μL、10× PCR Buffer 2.5μL、25mmol/L MgCl21.5μL、dNTP Mixture 2μL、ddH2O補足25μL，設陰性對照。PCR擴增程序：95℃預變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環；72℃延伸10min。PCR產物送寶生物工程(大連)有限公司測序。序列通過Blast在GenBank中進行同源性分析，選取與該序列相似度高的序列，采用MEGA4軟件的ClustalX2子程序進行多序列比對后構建系統發育樹。

1.5.4 腸球菌的毒力檢測

1.5.4.1 溶血實驗

具體操作參見文獻[20]。

1.5.4.2 PCR檢測毒力因子

以基因組DNA為模板，PCR擴增待測菌的毒力因子。PCR反應體系同1.5.3.2節。PCR擴增條件，參見文獻[12-16]。PCR產物送寶生物工程(大連)有限公司測序。序列通過Blast在GenBank中進行同源性分析。

1.5.5 細菌素的生物學特性研究

1.5.5.1 細菌素對pH值、溫度和酶的敏感性

用HCl和NaOH將細菌素發酵上清液、鹽析液和粗提液分別調至pH2.0～12.0，采用牛津杯雙層瓊脂法檢測抑菌活性。細菌素樣品分別于60、80、100、115、121℃處理20min后，檢測抑菌活性。模擬人體內環境條件下，測定細菌素發酵上清液和粗提液的酶敏感性，具體操作參見文獻[18]。粗提液做水浴4h和6h的酶解實驗。于酶最適作用pH值和最適作用溫度下，測定粗提液的酶敏感性。將其酶解2h后調回對照pH6.0，檢測抑菌活性。

1.5.5.2 抑菌譜測定

霉菌采用涂布法制備檢測平板，其他菌株采用傾注法制備檢測平板。加樣后，置于適宜溫度培養16～48h(培養時間根據菌的生長情況而定)，測定抑菌圈直徑大小。

2 結果與分析

2.1 產細菌素菌株的篩選

通過打孔法確定34株疑似乳酸球菌中有16株菌的發酵上清液對指示菌有抑制作用，產抑菌物質的菌株占測試菌株的47.06%。將16株菌的發酵上清液調pH值至6.0后，僅有SAU-2對指示菌有抑制作用，抑菌圈直徑為9.26mm。菌株SAU-2的發酵上清液排除H2O2后，抑菌活性無變化。該抑菌物質能被胰蛋白酶和蛋白酶K完全降解，確定該抑菌物質為蛋白質。經80%飽和度(NH4)2SO4沉淀的鹽析液和粗提液抑菌圈直徑約為17mm，抑菌活性顯著高于發酵上清液，證明該抑菌物質的蛋白質特性。以上表明菌株SAU-2為細菌素產生菌。

2.2 菌株SAU-2的鑒定

2.2.1 菌體形態和生理生化實驗結果

菌株SAU-2在MRS瓊脂平板上為大小約1mm、露滴狀、光滑、低凸起、邊緣整齊、圓形、無光澤、質地松軟、乳白色、不透明菌落；革蘭氏染色顯示其為成對或成堆排列的G＋球菌。菌株SAU-2的生理生化特征如表2所示。綜合形態特征及生理生化特征，根據《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[19]，初步將菌株SAU-2鑒定為Enterococcus。

表2 菌株SAU-2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of SAU-2

2.2.2 菌株SAU-2基于16S rDNA基因的分子生物學鑒定

采用NCBI數據庫中的Blast程序比對菌株SAU-2的16S rDNA序列(登錄號為JF825531)和GenBank中的核酸數據，發現菌株SAU-2與腸球菌(Enterococcus sp.) SL02、SL03、SL04的相似性為98%，與芒地腸球菌(E.mundii) ATCC 43186、芒地腸球菌SS 1232、海氏腸球菌(E.hirae)NRIC 0109及屎腸球菌(E.faecium)SH 632的相似性為98%。因其16S rDNA序列與確定種名的菌株相似度最高僅為98%，故不能確定該菌的種名，僅能將菌株SAU-2鑒定為Enterococcus。菌株SAU-2在系統發育樹上與SL02等腸球菌處于發育樹的同一分支；與副腸系膜明串珠菌NCFB 2973(L.paramesenteroides)等近緣乳酸菌親緣關系較遠，基于16S rDNA的系統發育樹如圖1所示。

圖1 菌株SAU-2的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SAU-2 based on 16S rDNA sequence

2.3 腸球菌SAU-2的毒力檢測

2.3.1 溶血性實驗

將腸球菌SAU-2劃線于含體積分數5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂上，于37℃培養24h后，未出現溶血圈，表明其不產溶血素。

2.3.2 PCR檢測腸球菌SAU-2的毒力因子

圖2 腸球菌SAU-2的毒力因子擴增產物電泳Fig.2 Eelectrophoresis of PCR amplification products of virulence factors

由圖2可知，腸球菌SAU-2未擴增出agg、gelE、cylM、cylB、cylA、esp、efaAfm、cpd、cob、ccf、cyILL、cyILS、fsrB和hyLEfm等毒力因子的特異性片段。說明腸球菌SAU-2不存在以上毒力因子，腸球菌SAU-2是安全的。

2.4 SAU-2所產腸球菌素的生物學特性

2.4.1 細菌素的作用pH值范圍

圖3 SAU-2所產腸球菌素的活性pH值范圍Fig.3 Effect of pH on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2

由圖3可知，細菌素發酵上清液、鹽析液和粗提液顯示活性的pH值范圍很廣，發酵上清液顯示活性的pH值為2～9，鹽析液為2～10，粗提液為2～12。表明隨著純化的進行，腸球菌素SAU-2的活性pH值范圍不斷擴大。隨著pH值升高，發酵上清液、鹽析液和粗提液的抑菌活性都呈下降趨勢。當pH值為2～5時，細菌素抑菌活性隨pH值升高快速下降；當pH＞5時，細菌素抑菌活性緩慢下降。

2.4.2 細菌素的熱穩定性

圖4 腸球菌素SAU-2的熱處理結果Fig.4 Effect of heat on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2

由圖4可知，隨著處理溫度的升高，細菌素發酵上清液、鹽析液和粗提液活性喪失很少。經121℃處理20min，細菌素發酵上清液、鹽析液和粗提液殘留的活性分別為原液(對照)的92%、97%和96%。表明腸球菌素SAU-2對熱很穩定。

2.4.3 細菌素的酶敏感性

由圖5可知，模擬人體內環境條件下，細菌素發酵上清液經胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性完全喪失；經木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理后，活性基本無變化。粗提液經胰蛋白酶和蛋白酶K處理2、4、6h后，抑菌活性有所下降；經木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理2、4、6 h后，活性幾乎無損失。表明模擬人體內環境條件下，細菌素發酵上清液和粗提液對胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的敏感性，對木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

圖5 腸球菌素SAU-2的酶敏感性Fig.5 Antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2 after treatment with various proteases

在酶最適作用pH值和最適作用溫度下，細菌素粗提液經胰蛋白酶處理后抑菌活性有部分降低；經蛋白酶K處理后活性損失殆盡；經木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理后活性無變化。表明在酶處于最適作用pH值和最適作用溫度下，粗提液對蛋白酶K敏感性強，對胰蛋白酶有一定的敏感性，對木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

2.4.4 細菌素的抑菌譜

表3 腸球菌素SAU-2的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of enterocin SAU-2

由表3可知，腸球菌素SAU-2對測試的9株G+細菌中的8株有抑菌活性，抑菌率為89%(8株/9株)。其對單核細胞增生李斯特氏菌GIM1.228表現出很強的抑菌活性(粗提液抑菌圈為35.02mm)；對2株芽孢桿菌有抑制作用；對銅綠假單胞桿菌ATCC 27853有抑菌活性；對測試的7株近緣乳酸菌均具有較強的抑菌活性；粗提液對1株紅酵母也具有一定的抑菌活性。對測試的其他細菌和真菌無抑制作用(表3未列出，具體菌種見1.1節)。以上表明該細菌素主要對近緣乳酸菌和G+細菌有抑菌作用，與大多數乳酸菌素的抑菌譜類似。粗提液對1株紅酵母產生抑制作用，而發酵上清液和鹽析液未表現出抑菌活性，表明隨著細菌素純度的提高，有可能會拓寬其抑菌譜。

3 討 論

3.1 產細菌素乳酸菌的篩選

迄今，除Nisin之外，已逾百種乳酸菌素被發現[2]。而多數乳酸菌素僅在酸性或中性pH值條件下才穩定。因此，篩選寬譜pH細菌素具有重要意義。本實驗采用調節發酵上清液pH值至6.0來篩選產寬譜pH細菌素的潛力菌株，優于敖靈[4]、張艾青[17]等調pH4.5(僅排除有機酸干擾)及李悅[21]、吳榮榮[22]等調pH值至5.0篩選細菌素產生菌。

3.2 腸球菌的益處和潛在危害

腸球菌廣泛存在于自然界，其對地中海奶酪等發酵食品形成獨特風味具有重要作用。腸球菌還被作為益生菌應用于嬰兒配方食品、食品發酵劑和飼料添加劑。一些腸球菌還能產細菌素，從而抑制李斯特氏菌等致腐菌和致病菌，延長食品保質期。但是某些腸球菌攜帶毒力因子。而且耐萬古霉素腸球菌(VRE)菌株數量不斷上升，隨著菌株的使用，可能會增加耐藥基因的傳播。因此，將腸球菌用于食品工業前，必須確保該菌株不含任何毒力因子和可傳遞的耐藥基因。本實驗對腸球菌SAU-2進行了毒力評價，結果顯示腸球菌SAU-2為溶血素表型陰性和毒力因子基因型陰性，表明其是安全的，可作為食品發酵劑的后備菌種。

3.3 腸球菌素的特性

細菌素在適宜pH值環境下，才表現出抑菌活性；pH值過高或過低都會影響細菌素結構，從而降低或喪失抑菌活性。目前，發現的大多數腸球菌素具有較好的pH值穩定性[9,23-25]。本研究的腸球菌素SAU-2活性pH值范圍很廣，能夠適應不同食品的pH值要求。

乳酸菌素對熱的穩定性因種類不同有一定差異。而發現的大部分腸球菌素都能耐受巴氏殺菌(65～80℃，15min)及以上溫度[9,23-27]。本研究的腸球菌素SAU-2經121℃處理20min，抑菌活性幾乎無降低。表明該細菌素對熱很穩定，能夠滿足食品加工過程對添加物質耐熱的要求。

細菌素基本屬于蛋白質或多肽范疇，往往能被蛋白酶類分解。其若能被酶類分解，就不會在體內蓄積，對評價細菌素的安全性具有重要意義。少數細菌素還能被淀粉酶和脂肪酶分解失活[28-29]。本研究的腸球菌素SAU-2對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，說明其作為食品防腐劑使用的安全性。而酶處于不同作用條件，對細菌素的降解能力有一定差異。本研究的細菌素粗提液在模擬人體內環境條件下，只能被蛋白酶K部分降解；而在酶最適作用pH值和最適作用溫度下，能被蛋白酶K完全降解。

目前發現的腸球菌素主要抑制G+細菌，少數腸球菌素還能抑制大腸桿菌、沙門氏菌和假單胞等G-菌[9]。已發現的腸球菌素能抑制真菌和病毒很少。岳喜慶等[27]的屎腸球菌BC-3所產細菌素能抑制米曲霉，Wachsman等[30]的屎腸球菌素CRL35能抑制皰疹病毒。本研究的腸球菌素SAU-2主要對近緣乳酸菌和G+細菌有抑菌作用，與大多數乳酸菌素的抑菌譜類似。其對G-菌和真菌幾乎無抑菌性，可以通過添加其他抑菌物質協同抑制得以改善。

本研究從川西高原奶渣中篩選到1株產寬譜pH細菌素的腸球菌SAU-2。腸球菌SAU-2溶血素表型陰性，agg等14個毒力因子基因型陰性，表明腸球菌SAU-2是安全的。腸球菌素SAU-2具有較寬的pH值作用范圍、良好的熱穩定性和較廣譜的抑菌性，具有作為天然食品防腐劑的潛在應用價值。

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Screening, Identification and Toxicity of a Strain of Wide pH Spectrum Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria and Characterization of Bacteriocin Produced by It

ZHOU Jia，LIU Shu-liang*，HU Xin-jie，ZHANG Yuan-e
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

SAU-2, a bacteriocin-producing strain, was screened out of 34 strains isolated from milk residue in West Sichuan plateau. The strain was identified as Enterococcus based on colonial morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence phylogenetic analysis. SAU-2 had no hemolytic activity. All the virulence factors of agg, gelE, cylM, cylB, cylA, esp, efaAfm, cpd, cob, ccf, cyILL, cyILS, fsrB and hyLEfm were negative. These results indicate that SAU-2 is safe. In addition, bacteriocin produced by SAU-2 could tolerate heat treatment at 121 ℃ for 20 min, and exhibited antibacterial activity at pH 2.0—12.0, but was sensitive to trypsin and proteinase K. It showed strong inhibitory effect on relative strains of SAU-2 and Gram-positive bacteria, and could also inhibit one strain of Pseudomonas aeruginosa and one strain of Rhodotorula glutinis, but had no inhibitory effect on other Gram-negative bacteria and fungi.

milk residue；Enterococcus；bacteriocin；virulence factors；characterization

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0194-06

2011-05-31

四川省教育廳重點項目(07ZA054)；四川省科技廳泡菜產業鏈項目(09ZC1270-4)

周佳(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：zj.onef@163.com

*通信作者：劉書亮(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lsliang999@163.com