紅曲菌的復合誘變及其固態發酵條件的優化

楊歡歡，胡中澤*

(武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

紅曲菌的復合誘變及其固態發酵條件的優化

楊歡歡，胡中澤*

(武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

通過紫外線和LiCl對一株紅曲菌MP進行復合誘變，并通過響應面法對其固態發酵條件進行優化分析。結果表明：在前期溫度為30℃，后期溫度為24℃，初始含水量為60%的條件下，Monacolin K的產量最高可達5.33mg/g。

紅曲菌；復合誘變；Monacolin K；響應面

紅曲起源于中國，其在食品方面的應用已很廣泛。目前，隨著對紅曲研究的深入，紅曲在醫藥保健方面的用途也越來越受關注，其中功能性紅曲在此方面的價值更為突出。功能性紅曲是指可降膽固醇、治療高血脂的紅曲[1-2]。

紅曲菌的主要功能性產物之一——Monacolin K是日本遠藤章利用小型發酵罐深層發酵培養紅曲菌得到的。Monacolin K抑制膽固醇形成的機理是Monacolin K能競爭性地抑制羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA) 還原酶(HMG-R)，進而抑制了膽固醇的合成，其中HMGCoA還原酶是膽固醇合成中的限速酶[3]。Monacolin K還能增加膽固醇的分解代謝，降低甘油三酯及低密度脂蛋白(LDL)[4]。由于此種特性，如何提高紅曲菌中Monacolin K的產量成為研究重點。

目前紅曲生產中廣泛采用的是固態發酵法，其具有投資少，產量大，生產經驗豐富等優點[5]。生產Monacolin K一般也利用紅曲菌固體發酵法，但在工業化固體培養時，培養條件對其產量的影響很大，因此合理設計固態發酵工藝條件是達到高產Monacolin K目的的關鍵步驟[6]。

本實驗利用理化復合誘變方法提高紅曲菌產Monacolin K的能力，并通過響應面分析法研究固態發酵過程中各工藝條件對紅曲生產Monacolin K的影響，最終得到固態發酵條件的最優組合。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

紅曲菌MP 本實驗室分離保藏。

基礎培養基：麥芽汁10°Bx，瓊脂2%。用作斜面和平板培養。固態發酵培養基：適量發芽糙米洗凈浸泡后于250mL錐形瓶中蒸煮，滅菌20min。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇、磷酸(分析級)、乙腈(色譜級)、洛伐他汀對照品。

PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；YM50型不銹鋼立式蒸汽消毒器 上海三申醫療器械有限公司；YM50型不銹鋼立式高壓蒸汽滅菌箱 上海三申醫療器械有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱上海精密實驗設備有限公司；SW-CJ-2D型凈化工作臺廣州瑞智科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株誘變的處理方法

在紅曲菌的培養過程中，Monacolin K是次級代謝產物，代謝機制復雜，其產量是由多基因決定的，誘變后產量提高是多基因效應的結果[7]。本實驗采用LiCl作為化學因子和UV作為物理因子對紅曲菌MP進行復合誘變處理。

具體操作步驟：量取6mL孢子懸液于無菌平皿中，在距離紫外燈30cm處打開皿蓋開始照射。將照射后的菌懸液轉入無菌試管中，并立即浸入冰水中暗室保存3h。按10倍稀釋法將經UV處理過的孢子懸液依次稀釋，并各吸取0.1mL涂布在含有0.8g/L LiCl溶液的平板上，放入暗室中34℃培養6d，以備分離篩選[7]。

1.3.2 誘變篩選

在對菌種進行誘變時，只有每次誘變后有1～2個控制產量的基因突變，使產量合成稍有增加且又能維持其最起碼代謝平衡的菌株才能生存下來，因此，高產菌株的產量提高，是通過多代誘發突變逐漸積累的結果[8]。

采用傳統選育中常用的方法，挑選的菌落直接接入固體培養基中培養。

第一代：紅曲菌MP→制備孢子懸液→UV照射→分離到含有LiCl的MEA平板上→挑選200個菌落→初篩50株→復篩4株[8]。第二代：出發菌株4株→制備孢子懸液→UV照射→分離到含有LiCl的MEA平板上→挑選200個菌落→初篩50株→復篩4株。第三、四代與以上操作方法相同。

初篩：選擇生長速度減緩和形態發生明顯變異的菌落。

復篩：對初篩出的50株紅曲菌進行固態發酵培養14d，采用HPLC法對發酵產物中的Monacolin K進行定量檢測，篩選出產量高的菌株[9-10]。

1.3.3 HPLC法定量檢測

樣品處理：將發酵后的紅曲米于60℃烘干至質量恒定，研磨過100目篩。取適量樣品溶于5mL流動相中，并超聲助溶30min，40℃水浴1h，5000r/min離心15min，取上清液過0.45μm濾膜待用。

色譜柱：Welchrom-C18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長：238nm；流動相：乙腈-磷酸水溶液；流速：1mL/min；進樣量：20μL。

1.3.4 響應面試驗分析法

在紅曲菌固態發酵萌芽米過程中采用變溫培養，以前期培養溫度、后期培養溫度以及初始含水量為3個主要影響因素，進行單因素試驗，基于單因素試驗結果確定響應面試驗因素水平。具體設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平及編碼設計表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 復合誘變

2.1.1 紫外線復合0.8g/L LiCl誘變對菌株的影響

選擇紫外線照射時間分別為15、30、45、60、75、90、105、120s，將孢子懸液涂布在含LiCl質量濃度為0.8g/L的MEA平板上，觀察紅曲菌的生長情況。

圖1 紫外線照射時間對紅曲孢子的致死作用Fig.1 Lethal effect of UV light on Monascus purpureu

由圖1可知，孢子的致死率隨著紫外照射時間的延長而增大，當照射時間為120s時，孢子的致死率近100%。而照射時間90s時致死率為90%左右，將此時間作為復合誘變處理的紫外照射時間。

2.1.2 復合誘變篩選出菌種的發酵產量

圖2 突變菌株和出發菌株M-H2的比較Fig.2 Comparative monacolin K yield of original strain M-H2 and its mutant strains

對紅曲菌MP進行上述復合誘變，誘變條件為紫外照射時間90s，LiCl質量濃度為0.8g/L。MP經誘變后得到80多株突變株，挑取菌落形態發生明顯變異的30株進行固態發酵培養14d，采用HPLC法對發酵產物中的Monacolin K進行定量檢測。按1.3.2節的篩選步驟和方法，連續誘變4代后得到以下突變株，結果如圖2所示。15株菌株為第一、二、三代突變株中Monacolin K產量較高菌株，而第四代誘變時，相同條件下致死率下降，產Monacolin K能力無明顯變化。經過初篩和復篩，并與誘變前進行比較得到目的菌株M-H4-3，其Monacolin K的產量為4.02mg/g，而相同發酵條件下出發菌株M-H2的Monacolin K的產量僅為2.35mg/g。

2.1.3 遺傳穩定性實驗

對目的菌株M-H4-3進行遺傳穩定性實驗，將其接種在麥芽汁培養基上連續傳代至第五代，每代均接種到萌芽米上進行固態發酵培養。利用HPLC法對發酵樣品進行檢測，結果見圖3。菌株M-H4-3在固態發酵萌芽米過程中對Monacolin K有較高的產量，且性能穩定。

圖3 突變株M-H4-3遺傳穩定性實驗結果Fig.3 Genetic stability of mutant strain M-H4-3

2.2 前期溫度對Monacolin K產量的影響

圖4 前期溫度對Monacolin K產量的影響Fig.4 Effect of initial temperature on monacolin K yield

Monacolin K是紅曲發酵過程中產生的次級代謝產物，而次級代謝的一個重要特征是其代謝產物一般只在菌絲體的生長速率降低時才合成[11]，因此Monacolin K的形成應滯后于菌絲體的生長，而紅曲菌絲體的良好生長是高產Monacolin K的重要基礎[12]。采用變溫培養，在其他條件不變的情況下，首先固定后期溫度為25℃，研究前期發酵溫度對Monacolin K產量的影響，結果見圖4。30℃時Monacolin K產量最高，之后Monacolin K產量隨著溫度的升高而增大，當溫度升至38℃時幾乎沒有產量，說明此溫度紅曲菌菌絲體幾乎不生長。

2.3 后期溫度對Monacolin K產量的影響

在紅曲米發酵過程中后期溫度直接影響Monacolin K在菌絲體生長中的代謝積累[13]，因此，固定前期溫度30℃，后期溫度分別設為20、24、28、32℃培養紅曲米，研究后期溫度對Monacolin K產量的影響，結果見圖5。

圖5 后期溫度對Monacolin K產量的影響Fig.5 Effect of late temperature on monacolin K yield

由圖5可知，后期溫度為24℃時Monacolin K的產量達到最大，而當溫度高于24℃時Monacolin K的產量驟降，當后期溫度高于前期溫度時紅曲生長緩慢幾乎不代謝Monacolin K。

2.4 初始含水量對Monacolin K產量的影響

圖6 初始含水量對Monacolin K產量的影響Fig.6 Effect of original moisture content on monacolin K yield

在固態發酵時，孢子萌發及菌絲生長都需要適宜的水分，而固態發酵最大的特點就是無游離水[14]，因此底物含水量的變化對微生物的生長及代謝能力會產生重要的影響[15]。在其他條件不變的情況下進行發酵實驗，研究初始含水量對Monacolin K產量的影響，結果見圖6。在初始含水量60%時Monacolin K累積量達到最大值，通過觀察各水平紅曲米的發酵生長情況得知潮濕的環境比較適合紅曲菌的生長。

2.5 固態發酵條件的響應面分析結果

以Monacolin K的產量為響應值(Y)，通過Box-Behnken設計并進行試驗，得到紅曲菌固態發酵萌芽米的最優組合條件。結果見表2。方差分析見表3。根據回歸方程，采用軟件繪制響應面和等值線圖，考察響應曲面情況，見圖7。

表2 響應面試驗設計方案與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

對表2中的數據進行二次多項回歸擬合，獲得回歸方程：

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression equations

對回歸方程求一階偏導數并等于零，得到有3個方程組成的方程組，解答該方程組得到：X1＝30.53，X2＝25.68，X3＝60.07。即應用數學模型得出的理論最優培養條件：前期溫度為30.53℃，后期溫度為25.68℃，初始含水量為60.07%，Y的最大值為5.92mg/g。而第4組試驗的產量最高，即在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，Monacolin K產量是5.69mg/g。因此可以看出理論最優點在此附近。

由表3可知，一次項以及二次項對響應值的影響均很顯著，交互項則不顯著。在此模型中失擬項不顯著，回歸高度顯著，可以用此模型進行響應值的預測。模型的復相關系數的平方R2＝0.9981，說明回歸方程的擬合程度良好，可以用該方程代替真實試驗點進行分析。

圖7 前期溫度、后期溫度和初始含水量對Monacolin K產量影響的響應面及等值線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of initial temperature, late temperature and original moisture content on monacolin K yield

2.6 擬合優化的驗證

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，通過重復性實驗對統計分析計算出的理論最優條件進行驗證，即在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，用目的菌株M-H4-3固態發酵萌芽米，進行5次固態發酵所得的實驗數據的平均值為5.33mg/g，與理論值的相對誤差為0.91%。

3 結 論

3.1 以LiCl作為化學因子和UV作為物理因子對紅曲菌MP進行復合誘變處理，通過反復誘變和篩選得到一株Monacolin K產量較高的菌株M-H4-3，其產量為4.02mg/g，與作為對照的出發菌株(2.35mg/g)相比，其產量提高1.7倍。

3.2 通過單因素及響應面試驗對紅曲菌固態發酵萌芽米條件進行優化，并通過Box-Behnken試驗設計，建立紅曲菌固態發酵萌芽米過程中Monacolin K代謝積累的回歸模型，分析各因素效應的顯著性以及兩兩因素間的交互作用。在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，Monacolin K產量提高至5.33mg/g。

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Combined Mutation of Monascus and Optimization of Fermentation Conditions for Monacolin K Production

YANG Huan-huan，HU Zhong-ze*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

A strain of Monascus purpureu was treated with UV irradiation and its spore was then incubated in media containing LiCl to induce mutation. A mutant strain with high yield of monacolin K was obtained and its fermentation conditions were optimized for monacolin K production. The results showed that the optimal fermentation conditions were initial temperature of 30 ℃, late temperature of 24 ℃ and original moisture content of germinated brown rice of 60%. Under these conditions, the yield of monacolin K reached 5.33 mg/g.

Monascus；combined mutation；monacolin K；response surface methodology

Q939.99

A

1002-6630(2012)11-0247-05

2011-05-18

湖北省自然科學基金重點項目(2009CDA099)

楊歡歡(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：yanghuanhuan022@126.com

*通信作者：胡中澤(1968—)，男，教授，碩士，研究方向為糧油工程。E-mail：hzz1968@126.com