多菌種發酵青稞酒化學成分變化研究

曹 妍，杜木英,2,*，闞建全,2，陳宗道,2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

多菌種發酵青稞酒化學成分變化研究

曹 妍1，杜木英1,2,*，闞建全1,2，陳宗道1,2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

研究青稞酒多菌種曲發酵過程中化學成分的動態變化規律并與傳統曲發酵進行比較。結果表明：青稞酒的多菌種曲發酵過程中，表現出類似傳統曲發酵過程中各成分的動態變化趨勢。pH值明顯下降，之后穩定在pH4.0～4.3；總酸含量隨著發酵時間延長顯著上升(P＜0.05)，發酵60h時達到最大值0.83g/100g，之后略有下降；發酵品溫先緩慢上升，再緩慢下降，最高達36.2℃左右；還原糖含量和糖化酶活力值都在24h內顯著增加之后逐漸下降；總糖含量顯著下降，酒精體積分數顯著增高(P＜0.05)，多菌種曲發酵的酒精體積分數可達到10.30%，比傳統曲發酵提高57.73%；酒醅中酸性蛋白酶活力及氨態氮含量同時呈顯著性增高，24h后，蛋白酶活力及氨態氮含量逐漸降低；多菌種曲發酵的青稞酒總氨基酸含量80.923mg/100mL，缺乏蛋氨酸。感官評定表明風味較好的多菌種青稞酒的發酵時間約為60～72h，并保持了傳統青稞酒的主體風味。

青稞酒；多菌種發酵；化學成分

青稞，學名Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.，又稱為裸大麥，元麥，裸麥，屬于禾本科植物，谷物中大麥的一類。青稞最早被殷墟甲骨文記載為“來”，后來被證實其為青稞[1]。青稞酒，藏語叫做“羌”，從古至今，一直是藏族人民最喜歡喝的酒。“菌種是發酵業的靈魂”，釀酒發酵中常用菌種有黃米曲霉、根霉、毛霉、紅曲霉、釀酒酵母、生香酵母等。藏曲是西藏人民按照自己的傳統自然接種方式制作而成的釀酒發酵劑的統稱。青稞酒的曲均為自然曲，曲中都含有根霉、毛霉、曲霉、酵母和產酸菌及其他雜菌[2]。與傳統的自然曲發酵相比，人工純化菌種，以多菌種曲進行發酵釀酒的相關報道較少。

青稞酒是一種具有民族特色的低度發酵酒，與目前市面上的黃酒、啤酒、清酒及米酒等有較大的差別，它除了具發酵酒特有的甜酸味外，還有濃郁的青稞酒特有的醇香味及混濁的體態。近年來，我國飲料酒工業發展迅速，但花色品種不多，各大酒業集團公司都在加大科技投入，研究換代產品。目前對黃酒等的研究已經越來越深入[3-8]，國外對日本清酒、特色發酵酒的純種發酵研究也很多[9-12]。

本實驗利用在傳統青稞酒發酵過程中篩選并選育出的優良菌株制成的多菌種曲進行青稞酒發酵實驗，以傳統優良青稞酒曲發酵青稞酒作為對照，跟蹤整個發酵過程，研究青稞酒多菌種發酵過程中的各成分動態變化，為青稞酒工業化產品的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞、青稞酒傳統優良酒曲 西藏拉薩；多菌種曲 實驗室自制的米根霉純種曲和酵母固體曲復配而成。

1.2 儀器與設備

FA2004A型電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；JJ-2(B)型組織搗碎勻漿機 上海標本模型廠；PHS-3C+智能酸度計 成都方舟科技開發公司；722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Kjeltec 2300自動凱氏定氮儀 丹麥Foss Tecator AB公司；CS101-1A型電熱鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 青稞酒釀造工藝流程

1.3.1 傳統發酵青稞酒

青稞→浸泡→蒸煮→攤涼→拌入青稞酒傳統酒曲(酒曲加量為原料青稞質量的0.4%～0.5%)→28～30℃糖化發酵72h→青稞酒醅→加涼開水浸泡4h以上→過濾→青稞酒

1.3.2 多菌種發酵青稞酒

酒曲用多菌種曲接種，加入量為原料青稞質量的5%，其余步驟同傳統發酵。

1.3.3 取樣方法

分別進行多菌種曲發酵和傳統曲發酵，在發酵期間，每隔12h均勻取樣，用組織粉碎機粉碎，作為實驗的樣品。對照為經蒸煮過的青稞，重復3次。

1.3.4 理化指標的測定

pH值、總酸含量、氨態氮含量的測定方法參考文獻[13]；糖化酶活力、還原糖含量、總糖含量、酒精體積分數、酸性蛋白酶活力的測定方法參考文獻[14]；水分含量的測定方法參考文獻[15]；α-淀粉酶活性的測定方法參照文獻[16]。

1.3.5 青稞酒的感官評定

選擇10名經過食品感官評定訓練的具有豐富經驗的師生參照表1的標準進行色、香、味、格綜合打分評定，總分15分。

表1 感官評定標準Table 1 Standards for sensory evaluation of highland barley wine

1.4 數據處理與分析

所有的實驗數據都是3次實驗的平均值，用Origin8.5軟件作圖，并用SPSS11.5進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 發酵酒醅的pH值及總酸含量的變化

青稞酒發酵過程中發酵醪液的pH值與微生物的生長繁殖和代謝產物的積累有密切關系，是微生物在特定環境下代謝活動的綜合指標，能夠判斷酒精發酵是否正常，是一項重要的發酵參數。青稞酒的總酸較之我國著名發酵酒黃酒，國外發酵酒如印度米酒等都高，說明青稞酒有不同于這些發酵酒的獨特環境和發酵基質。

圖1 發酵酒醅pH值及總酸變化趨勢Fig.1 Changes of pH and acidity of highland barley during fermentation

由圖1可知，多菌種曲和傳統曲發酵pH值變化趨勢基本一致，0～24h期間pH值明顯降低，之后趨于平穩，穩定在4.0～4.3之間。說明24h內微生物大量繁殖，快速進入產酸階段，產生大量有機酸。后酵期pH值較穩定，可能是由于后期糖類物質供應不足，使生成的有機酸部分作為碳源被微生物利用消耗。

總酸含量是衡量發酵是否正常和酒質優劣的重要參數。多菌種曲發酵的酒醅總酸則隨著發酵時間延長顯著上升(P＜0.05)，發酵60h時達到最大值0.83g/100g，之后略有下降。統計分析表明，多菌種曲pH值與多菌種曲總酸含量之間呈極顯著正相關(P＜0.01)；而傳統曲pH值與總酸含量之間相關性不顯著(P＞0.05)。多菌種曲pH值與總酸相關性好說明醪液中酸的種類較少，酸較強，易于控制酒醅pH值和總酸，實現工業化生產，并保證產品的質量穩定。而傳統曲二者相關性差表明其中酸的種類多，這對于酒的風味是有利的，后續研究應篩選產風味菌株增強青稞酒的風味。

2.2 發酵過程中酒醅品溫的變化

圖2 發酵過程中酒醅品溫的變化Fig.2 Changes of temperature of highland barley during fermentation

溫度的變化能有效而且間接地反映出發酵狀況。適宜的品溫利于釀造微生物生長，使發酵順利進行。由圖2可知，多菌種曲和傳統曲的青稞酒醅在發酵過程中品溫均為先緩慢上升，到達最高溫度36.2℃后顯著下降(P＜0.05)，最后維持在28.1～30.0℃左右。前期降溫和淀粉降解速度小有很大關系[17]，之后品溫迅速提高，微生物進入旺盛的代謝時期，開始進行酒精發酵，溫度逐漸降低，最后溫度有所回升，可能是某些微生物又開始活動旺盛。微生物代謝產生呼吸熱，傳統曲在發酵的24h左右就升至36℃左右，可能是傳統曲中產酸微生物快速生長繁殖所致，所以傳統曲釀造的青稞酒的酸度較之同類型的發酵酒偏大。酒醅品溫“前期緩慢上升，后期緩慢下降”，符合微生物生長代謝的規律。

2.3 發酵過程中酒醅水分含量的變化

酒醅中霉菌酵母等微生物繁殖需要水分，糖化、發酵亦以水分作為媒介。在發酵過程中，如水分(總揮發物)不斷增加，則表明酒醅發酵越正常，越徹底。酒醅入池后溶氧存在于酒醅中，發酵過程中糖被分解，產生一定量的水分。由圖3可知，多菌種發酵的水分含量從發酵24h后就一直略高于傳統發酵，預示其發酵更為徹底，酒醅的水分含量在發酵過程中顯著增加(P＜0.05)，說明多菌種曲發酵進行正常。

圖3 發酵酒醅的水分含量變化趨勢Fig.3 Changes of water content of highland barley during fermentation

2.4 發酵過程中酒醅還原糖含量及糖化酶活力的變化

圖4 發酵酒醅還原糖含量及糖化酶活力變化趨勢Fig.4 Changes of reducing sugar content and glucoamylase activity of highland barley during fermentation

還原糖是青稞酒發酵過程中微生物直接利用的碳源物質，發酵過程中的動態變化直接影響酒精的生成，反映了發酵中微生物利用碳源的情況，其變化微妙地反映了發酵過程的協調程度。由圖4可知，在0～24h內，糖化酶活力及還原糖含量均顯著增加(P＜0.05)，因為根霉大量分泌糖化酶，還原糖含量逐步升高。24h后糖化酶活力逐漸降低，釀酒酵母利用還原糖進行酒精發酵，還原糖含量也隨之下降。多菌種曲還原糖含量與多菌種曲糖化酶活力之間呈顯著正相關(P＜0.05)，而傳統曲還原糖含量與傳統曲糖化酶活力相關性不顯著(P＞0.05)，再次證實了多菌種曲發酵的規律性和可控性。多菌種曲的酒醅殘糖也低于傳統曲發酵，說明多菌種曲發酵糖化力更強，發酵更徹底，有利于提高原料利用率。

2.5 發酵酒醅的酒精體積分數及總糖含量變化

圖5 發酵酒醅總糖含量及酒精體積分數變化趨勢Fig.5 Changes of total sugar content and alcohol volume fraction during fermentation

酒精是酒醅發酵的主要產物，含量多少是鑒定酒醅質量的主要指標，也是判斷發酵是否正常的重要依據。由圖5可知，在整個青稞酒發酵過程中，發酵酒醅的酒精體積分數顯著性增高(P＜0.05)，總糖含量呈顯著性下降趨勢(P＜0.05)。當發酵36h后，酒精體積分數趨于平穩，是因為發酵進入了以產酸產酯為主的階段，酯化作用和呼吸作用都會消耗乙醇，所以酒精體積分數保持平穩。多菌種曲酒精體積分數與多菌種曲總糖含量之間以及傳統曲酒精體積分數與傳統曲總糖含量都呈極顯著正相關(P＜0.01)。

多菌種曲發酵是本實驗室從傳統優良青稞酒曲中選育的高產糖化酶菌株和耐酒精能力達14%的酵母分別制曲，混合發酵，酒醅酒精體積分數顯著提高，由傳統曲的產酒精體積分數6.53%提高到 10.30%，比傳統曲發酵提高57.73%。

2.6 發酵過程中酒醅氨態氮及酸性蛋白酶的變化

氨態氮是構成微生物細胞蛋白質和核酸的主要元素，氨態氮在蒸煮時便溶解于水，使可溶性氮增加，有利于微生物的作用，是發酵微生物生長繁殖的所需主要氮源。氨態氮的利用能保證各種酶在內的蛋白質合成，使細胞中已有的酶活化。

圖6 發酵酒醅氨態氮及酸性蛋白酶變化趨勢Fig.6 Changes of ammonium nitrogen content and acid protease activity

由圖6可知，在0～24h內，酒醅中氨態氮含量及酸性蛋白酶活力同時呈顯著性增高(P＜0.0 5)；24 h后，蛋白酶活力逐漸降低，氨態氮被微生物利用，含量也降低。目前，關于發酵酒生產過程中氨態氮與酸性蛋白酶的變化之間的關系還未見其他報道。多菌種曲氨態氮與多菌種曲蛋白酶活力呈顯著正相關(P＜0.05)。傳統曲氨態氮與傳統曲蛋白酶活力呈極顯著正相關(P＜0.01)。

2.7 發酵過程中酒醅的α-淀粉酶活性的變化

圖7 發酵酒醅α-淀粉酶變化趨勢Fig.7 Change of α-amylases activity during fermentation

α-淀粉酶能在較高溫度下隨機水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，酶作用后可使糊化淀粉的黏度迅速降低，變成液體淀粉，水解生成糊精和少量葡萄糖、麥芽糖。由圖7可知，發酵酒醅α-淀粉酶在24h內顯著升高(P＜0.05)，然后又顯著下降(P＜0.05)。說明在24h時淀粉被水解速率最快，產生大量還原糖，為后期發酵提供充足的碳源。多菌種曲發酵過程中的α-淀粉酶最大值是傳統曲發酵α-淀粉酶最大值的3倍，α-淀粉酶活性高可以更快更有效的水解淀粉產生還原糖。

2.8 多菌種發酵曲青稞酒的游離氨基酸含量檢測結果

表2 多菌種發酵青稞酒的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition in highland barley wine fermented with multi-strain starter

由表2可知，多菌種發酵的青稞酒產品檢測出16種氨基酸，其總氨基酸含量80.923mg/100mL，略低于傳統優良青稞酒氨基酸含量，并且缺乏蛋氨酸。

2.9 多菌種曲發酵青稞酒與傳統發酵青稞酒的感官評定

不管是傳統曲還是多菌種曲，隨著發酵的進行，青稞酒中的甜、酸、酒香等逐漸形成，風味也逐漸變佳，多菌種曲發酵速度稍快，酒味更加濃郁，在60h已經具有青稞酒的典型風味。感官檢驗說明風味較好的多菌種曲或者傳統青稞酒的發酵時間約為60～72h。以傳統曲釀造的優良青稞酒為對照，對多菌種發酵青稞酒進行感官評價結果如表3所示，多菌種發酵的青稞酒的色澤淺灰色至淺黃色，色澤正，有光澤；香氣清爽、淡雅、醇香，沒有異雜味；口味清雅、爽口，甜味、酸味、澀味、苦味協調，口感醇和；整體表現為清雅、醇和，酒味較重，相互協調，具有青稞酒典型特征與風格。

表3 多菌種發酵的青稞酒的感官評價Table 3 Sensory evaluation score of barley wine fermented with multi-strain starter

多菌種發酵青稞酒乙醛等醛類大幅度減少，高級醇含量也低于傳統曲青稞酒，說明多菌種發酵能降低這兩類物質的含量，使青稞酒的安全性提高，具體表現為能減少傳統青稞酒飲后“上頭”的不適癥狀。多菌種發酵青稞酒在感官得分上接近傳統青稞酒，本實驗的多菌種曲發酵青稞酒，也經藏民同胞品嘗，普遍表示能夠接受這種新工藝青稞酒。說明本實驗生產的青稞酒保持了傳統青稞酒的主體風味。

3 結 論

青稞酒多菌種曲發酵過程中，表現出類似傳統發酵的物質成分動態變化趨勢，多菌種曲發酵，pH值和總酸的相關性好，說明醪液中酸的種類少，易于工業生產，控制產品質量，品溫緩升緩降，與傳統曲發酵相比變化趨勢更平緩，利于微生物生長。水分含量逐漸增高且大于傳統曲發酵，酒醅發酵更徹底。還原糖和糖化酶活力均高于傳統曲發酵，且在24h內顯著增加，酒醅殘糖更低，發酵更徹底，提高了原料利用率。總糖和酒精體積分數的相關性好，比傳統曲發酵更好的利用了還原糖進行酒精發酵，酒精體積分數提高了57.73%。酒醅中酸性蛋白酶活力及氨態氮含量同時呈顯著性增高。α-淀粉酶24h時活性最大，大量水解淀粉產生還原糖，是傳統曲α-淀粉酶的3倍。總氨基酸含量只有80.923mg/100mL，缺乏蛋氨酸，低于傳統曲發酵的青稞酒。感官評定表明風味較好的多菌種曲青稞酒的發酵時間約為60～72h，并保持了傳統青稞酒的主體風味。

青稞酒發酵過程中化學成分的變化會對酒的風味產生影響。國內對傳統發酵酒黃酒風味研究及國外對清酒的研究都較為成熟[18-23]，青稞酒的后續研究應借鑒這些方法，研究青稞酒主體風味成分的組成及形成機制，以期從根本上控制青稞酒的風味。

[1]徐廷文, 馮宗云. 從來牟的義釋談中國栽培大麥起源問題[J]. 西南農業學報, 2001, 14(1): 101-104.

[2]王麗華. 西藏傳統青稞酒的生產菌株選育及生產技術研究[D]. 重慶:西南大學, 2008.

[3]胡普信. 中國黃酒的科研現狀及發展[J]. 中國釀造, 2008(2): 4-6.

[4]劉俊, 徐巖, 趙光鰲. 優勢傳統黃酒類制造業關鍵技術與應用系列4: 黃酒非糖固形物成分的研究[J]. 中國釀造, 2009(8): 24-28.

[5]盛鳳云, 徐巖, 趙光鰲, 等. 優勢傳統黃酒類制造業關鍵技術與應用系列5: 液化法黃酒釀造新工藝中液化程度控制的研究[J]. 中國釀造, 2009(9): 110-114.

[6]毛青鐘, 宣賢堯, 魯瑞剛, 等. 機械化生產黃酒酵母菌生物學特性的研究[J]. 中國釀造, 2008(2): 29-32.

[7]壽虹志, 凌志勇, 楊旭, 等. 淺析黃酒麥曲中的微生物與黃酒風味的關系[J]. 中國釀造, 2007(8): 55-57.

[8]劉永樂, 俞健, 黃壽恩, 等. 甜型黃酒發酵過程中的生物和化學成分性質研究[J]. 中國食品學報, 2004, 4(1): 60-64.

[9]TAMANG J P, THAPA S. Fermentation dynamics during production of Bhaati Jaanr, a traditional fermented rice beverage of the Eastern Himalayas [J]. Food Biotechnology, 2006, 20: 251-261.

[10]DUNG N T P, ROMBOUTS F M, NOUT M J R. Functionality of selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters [J]. Food Microbiology, 2006, 23: 331-340.

[11]HOLZAPFEL W H. Use of starter cultures in fermentation on a household scale[J]. Food Control, 1997, 8: 241-258.

[12]DUNG N T P. Development of defined mixed-culture fungal fermentation starter granulate for controlled production of rice wine[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2005, 6: 429-441.

[13]胡明方. 食品分析[M]. 重慶: 西南師范大學出版社, 1992.

[14]王福榮. 釀酒分析與檢測[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005.

[15]杜木英, 伍怡酈, 闞建全, 等. 傳統青稞酒發酵過程中化學成分動態變化研究[J]. 食品工業科技, 2007, 28(9): 94-98.

[16]杜木英. 西藏青稞酒發酵微生物及釀造技術研究[D]. 重慶: 西南大學, 2008.

[17]黃建華. 衡水老白干酒醅發酵過程中主要成分變化及影響因素和金屬離子對老白干酒曲酯化酶影響[D]. 大連: 大連輕工業學院, 2007.

[18]ISOGAI A, UTSUNOMIYA H, IWATA H. Changes in the concentrations of sotolon and furfural during the maturation of sake[J]. J Brew Soc Jpn, 2004, 99(5): 374-380.

[19]ISOGAI A, UTSUNOMIYA H, KANDA R, et al. Changes in the aroma compounds of sake during aging[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(10): 4118-4123.

[20] ISOGAI A, UTSUNOMIYA H, KANDA R, et al. Aroma compounds responsible forin commercial sake[J]. J Brew Soc Jpn, 2006, 101(2): 125-131.

[21]TAKAHASHI M, ISOGAI A, UTSUNOMIYA H, et al. GC-Olfactometry analysis of the aroma components in sake koji[J]. J Brew Soc Jpn, 2006, 101(12): 957-963.

[22]LUO Tao, FAN Wenlai, XU Yan. Characterization of volatile and semivolatile compounds in Chinese rice wines by headspace solid phase microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Inst Brew, 2008, 114(2): 172-179.

[23]吳春. 古越龍山黃酒的特征風味物質及其成因的初步研究[D]. 無錫:江南大學, 2009.

Changes in Chemical Components during Fermentation of Highland Barley Wine with Multi-Strain Starter

CAO Yan1，DU Mu-ying1,2,*，KAN Jian-quan1,2，CHEN Zong-dao1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

The changes in chemical components of highland barley wine during fermentation with multi-strain starter were studied and compared with those of traditional fermented highland barley wine. The results showed that the dynamic change patterns of chemical components during fermentation with multi-strain starter and traditional starter were similar. pH value decreased rapidly at first and then kept stable at pH 4.0-4.3, the measured total acidity showed an increasing trend. Fermentation temperature increased first and then dropped gradually with the highest value of about 36.2 ℃. Saccharifying enzyme activity and reducing sugar content increased significantly during 0-24 h, and then decreased till the end of fermentation. Total sugar content kept decreasing throughout the whole process. The alcohol concentration fermented by multi-strain starter was 10.30% which indicated a significant (P ＜ 0.05) increase by 57.73% compared with that obtained using traditional starter. Both ammonia-N content and acid proteinase activity increased in the early stages of fermentation followed by a slow decrease. Total free amino acid (FAA) in the final product fermented by multi-strain starter was 80.923 mg/100 mL and no methionine was detected in it. Sensory evaluation showed that the optimal fermentation duration was 60-72 h for highland barley wine production by multistrain starter. Under this condition, the product was acceptable and maintained the major flavor of wine fermented by traditional starter as evaluated by sensory evaluation.

highland barley wine；fermentation with multi-strain starter；chemical composition

TS261.7

A

1002-6630(2012)11-0252-05

2011-09-30

中央高校基本科研業務費專項資金項目(XDJK2009C040) ；西南大學博士基金項目(SWUB2008068)

曹妍(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：watchmatch@163.com

*通信作者：杜木英(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為微生物與發酵工程。E-mail：muyingdu@swu.edu.cn