大黃酸對正常和氧化損傷內皮細胞的增殖和氧化保護作用

鐘先鋒，羅 婷，鄧澤元,*，劉 蓉，范亞葦

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000)

大黃酸對正常和氧化損傷內皮細胞的增殖和氧化保護作用

鐘先鋒1,2，羅 婷1，鄧澤元1,*，劉 蓉1，范亞葦1

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000)

目的：觀察大黃酸對正常和氧化損傷的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)的影響。方法：建立H2O2氧化損傷模型，采用不同濃度的大黃酸對內皮細胞進行處理，檢測內皮細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活力和超氧化物歧化酶(SOD) 活力及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力的變化；采用流式細胞術研究內皮細胞的凋亡情況，探討大黃酸對內皮細胞的保護作用。結果：大黃酸濃度在16μmol/L以下時，對HUVEC的增殖無顯著性影響；濃度在2μmol/L以上時，減輕HUVEC受到氧化損傷的程度，對氧化性損傷具有保護作用；同時降低了LDH釋放率，下調了MDA含量，提高了NO含量和NOS、SOD、GSH-Px的酶活力，顯著減少了細胞凋亡率。結論：HUVEC經2～16μmol/L大黃酸處理，可以有效減輕H2O2對其造成的氧化損傷，維持正常的生理形態。

大黃酸；氧化損傷；內皮細胞；增殖

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系統中常見的病理過程[1]?，F已得到廣泛公認的是AS的形成是由于各種損傷因素(氧自由基、高血壓、膽固醇低密度脂蛋白等)作用于血管內皮細胞(endothelial cell，EC)，導致內皮細胞功能障礙并進一步表達和釋放各種活性物質及黏附分子共同參與的慢性炎癥過程[2]。氧自由基等損傷因素存在于人類血漿及動脈斑塊中，對內皮細胞有較強的損害作用。氧化損傷內皮細胞的機制包括通過細胞毒性作用損傷內皮細胞，引起內皮細胞功能障礙和通透性增高，細胞膜內外物質組成和比例發生變化，改變血管的生理作用，使血管對一些因子失去反應；而且氧化損傷產生過量脂質過氧化物能使血管內皮細胞壞死，增強脂質蛋白對動脈壁的通透性；另外，通過各種途徑導致體內NO大量失活，從而減弱NO清除超氧化物的作用，進一步引起氧化，從而加重了氧化應激對血管內皮的損傷。內皮細胞損傷是AS的形成和發展的始動環節[3]，為了預防和治療AS，減少內皮細胞接觸損傷因素的機會是至關重要的，故進行早期逆轉內皮細胞氧化損傷導致的功能障礙對AS的發病具有積極的預防作用。

大黃酸(rhein)是我國蘆薈、大黃等傳統中藥的主要功效成分，屬單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，含有2個羥基和1個羧基，極性強，具有電化學氧化還原性質[4]。大黃酸及其衍生物(如大黃酸鬼臼毒素、賴氨大黃酸、大黃酸-N-β-羥乙基替加氟酯)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、瀉下、腎保護、影響心血管系統以及調脂等生理功能[5-7]。

本研究以培養的人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為材料，觀察大黃酸對HUVEC增殖的影響，探討大黃酸對損傷后HUVEC的保護作用。旨在篩選干預血管內皮細胞功能障礙的功效成分，從多路徑探討其作用的分子生物學機制，為預防和治療血管內皮功能障礙提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內皮細胞株由南昌大學醫學院提供；大黃酸購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110757-200206。

DMEM干粉培養基、胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑藍(MTT) 美國Sigma公司；LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

XSP-300顯微鏡 上海蔡康光學儀器公司；MK3酶標儀 芬蘭Thermo Multiskan公司；SW-CJ系列潔凈工作臺 蘇州凈化設備工程有限公司；CO2培養箱 日本三洋電氣公司；N15型臺式高速冷凍離心機 香港Heal Force公司；流式細胞儀 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

取人臍靜脈血管內皮細胞株復蘇，接種于50mL培養瓶內，待生長鋪滿后，經2.5g/L胰蛋白酶消化傳代，放置于37℃、體積分數5%的CO2培養箱培養，正常培養3～4代后分組實驗。

1.3.2 大黃酸對HUVEC增殖的影響(MTT法)

將80%融合生長的HUVEC以胰蛋白酶消化液消化，收集細胞，接種于96孔板。正常培養24h后，用磷酸緩沖液(PBS)洗去未貼壁細胞。換用無血清的培養基繼續培養8h，使細胞同步化。然后換用含5%胎牛血清和不同濃度大黃酸的DMEM培養液培養，其中1～6組大黃酸的濃度分別為64、32、16、8、4、2μmol/L，每組6個復孔，設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜(DMSO))，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、DMSO)，每組設定4復孔。培養24h后，移出培養液，換入無血清DMEM培養液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。繼續培養4h后，吸棄原培養液，每孔中加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，使結晶充分溶解，并用酶標儀490nm波長處檢測光密度(OD)值。定義對照組細胞存活率為100%，其余各實驗組細胞存活率按公式(1)計算。

1.3.3 大黃酸對HUVEC損傷的保護作用

將細胞分為對照組、H2O2組(200μmol/L H2O2)和大黃酸組(1～16μmoL/L大黃酸+200μmol/L H2O2)。前期實驗操作同1.3.2節，加入不同濃度的大黃酸后，培養24h，加入200μmol/l H2O2作用6h。然后換入無血清DMEM培養液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。繼續培養4h后，加入二甲基亞砜DMSO 150μL，用酶標儀490nm波長處檢測OD值，按照式(1)計算細胞存活率。

1.3.4 測定大黃酸對內皮細胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響

使用南京建成生物工程研究所L D H、M D A、NOS、NO、SOD、GSH-Px試劑盒測定每組HUVEC的各項指標。

1.3.5 流式細胞儀檢測內皮細胞凋亡

實驗分組同1.3.3節，不同處理的HUVEC用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗滌2遍，加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，使用5μL異硫氰酸熒光素(FITC)和5μL碘化丙啶(PI)在室溫避光反應10min，在1h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

表1 大黃酸對人臍靜脈內皮細胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響Table 1 Effect of rhein on LDH, MDA, NOS, NO, SOD and GSH-Px in HUVECs

2 結果與分析

2.1 大黃酸對HUVEC增殖的影響

圖1 不同濃度大黃酸對HUVEC增殖的影響Fig.1 Effect of rhein on the proliferation of HUVECs

由圖1可知，大黃酸濃度在16μmol/L及以下時，對HUVEC的增殖無顯著性影響，而達到32μmol/L時，對內皮細胞呈現一定的細胞毒性，故選擇大黃酸的添加濃度在16μmol/L以下，以此排除大黃酸對HUVEC的毒性損傷。

2.2 大黃酸對HUVEC氧化損傷的保護作用

圖2 不同濃度大黃酸對HUVEC氧化損傷的保護作用Fig.2 Protective effect of rhein on oxidative damage of HUVECs

由圖2可知，HUVEC經200μmol/L H2O2氧化損傷后，細胞存活率為76.3%，而在大黃酸濃度在2、4、8、16μmol/L時，內皮細胞的存活率分別為79.0%、81.1%、83.3%、89.5%，均有顯著保護HUVEC免受氧化損傷作用。

2.3 大黃酸對內皮細胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響

由表1可知，對照組和H2O2組相比較，LDH的釋放率和MDA含量分別從36.5%、26.15nmol/mg pro上升到54.9%、42.38nmol/mg pro；而NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力以及GSH-Px酶活力含量則由3.99U/mg pro、65.67μmol/L、120.08U/mg pro、151.82U/mg pro下降為1.84U/mg pro、24.64μmol/L、45.43U/mg pro、80.16U/mg pro。

比較大黃酸不同濃度組，發現隨著大黃酸濃度的增大，LDH的釋放率和MDA含量呈現下降趨勢，當大黃酸濃度大于4μmol/L時，LDH的釋放率和MDA含量與H2O2組相比，有顯著性差異。

對SOD、NOS、NO、GSH-Px這些指標的檢測結果顯示，HUVEC經過H2O2處理后，SOD酶活力、NOS酶活力、NO含量、GSH-Px酶活力均產生顯著降低，說明大黃酸對細胞造成了顯著的氧化性損傷，而加入大黃酸進行預防性保護后，NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力、GSH-Px酶活力都出現不同程度的回升。測定結果提示HUVEC經大黃酸預處理，可以有效減輕H2O2的氧化損傷，保護細胞免受更大的氧化性損傷。

2.4 流式細胞儀檢測HUVEC凋亡

圖3 FITC-PI通道的二維散點圖Fig.3 Bivariate graphs for the FITC-PI fluorescent resolution of EC

由圖3可知，HUVEC經H2O2氧化損傷后，41.7%的細胞進入早期凋亡，2.1%的細胞進入晚期凋亡或者壞死，而16μmol/L大黃酸處理后，有21.1%的細胞進入早期凋亡，0.7%的細胞進入晚期凋亡或者壞死，提示大黃酸可以保護HUVEC免受氧化損傷，降低細胞凋亡率，維持正常生理功能。

3 討 論

3.1 內皮細胞氧化損傷模型和藥物作用范圍的選擇

人體內代謝的各種反應，大多會產生自由基，其中以O2-·產生最快[8]。氧自由基可作用于內皮細胞細胞膜，引起鏈式過氧化反應，產生許多脂質過氧化物。脂質過氧化物不僅會損傷細胞DNA，誘導內皮細胞凋亡和壞死，而且可以作為非常重要的信使分子，介導各種各樣凋亡信號轉導。血管內皮細胞的過度凋亡在動脈粥樣硬化、冠狀動脈綜合癥等心血管疾病發生發展中起關鍵作用[9]。抑制氧自由基誘導的血管內皮細胞過度凋亡是心血管疾病防治的重點環節，而大黃酸有抗氧化和防治心腦血管病的作用[10]。建立細胞氧化損傷模型，多采用H2O2、ox-LDL、乙醇等試劑，本實驗利用H2O2產生O2-·來建立內皮細胞損傷模型，因為該系統較為穩定科學，簡便易行，適用于篩選藥物。綜合文獻和實驗室數據分析，實驗采用200μmol/L的 H2O2誘導內皮細胞損傷。

大量人工或者天然的食物和藥物對細胞都有細胞毒性，在研究各種藥物對細胞的保護作用時，應設法排除毒性對細胞的影響。大黃酸濃度在大于32μmol/L時，對人臍靜脈內皮細胞的增殖產生抑制作用，有顯著性差異。所以設計了添加1～16μmol/L的大黃酸作為藥物組濃度的實驗方案。

3.2 大黃酸保護HUVEC免受氧化損傷的機制

AS的發生是由于血管內皮細胞和平滑肌細胞受各種危害因素損傷[11]，使血管壁局部產生的過度慢性炎性反應，是細胞受損后的一種保護性反應，如果損傷加重，則會造成過度的炎性纖維增生性反應，最終導致動脈管腔的堵塞。有研究表明，內皮細胞的再生和增殖作用是動脈粥樣硬化的修復的關鍵環節[12]。

大黃酸(大于2μmol/L)可以增強內皮細胞抵御H2O2氧化損傷的能力，這可能與大黃酸具有較強的氧化還原能力有關。對LDH、MDA、SOD、NOS、NO、GSH-Px的測定結果也證實了這點。

LDH釋放率受H2O2氧化損傷的影響升高，這可能是因為細胞損傷時細胞質內氧依賴性酶及細胞膜結構受到影響，細胞膜通透性顯著提高，細胞內的LDH產生增加，同時向細胞外的漏出也相應增加。LDH釋放率反映了細胞膜受損傷的程度，是評估細胞損傷重要指標之一。MDA也是評估體內脂質過氧化程度的重要指標之一，間接反應細胞損傷的在體內的自由基可以通過鏈式反應，放大活性氧的危害[13]。大黃酸促進了NOS和NO的分泌量，而NOS和NO是維持血管正常生理功能的重要活性物質，是具有雙重作用的體內局部調節因子，與細胞的增生和分化有關，能清除體內自由基。大黃酸也促進了SOD和GSH-Px的分泌量，SOD能消除人體在吸收代謝過程中生成的有毒有害物質，人體不斷地補充 SOD具有抗衰老的特殊效果[14]，可以維持細胞內的氧化還原狀態的平衡；GSH-Px主要生理功能是清除自由基、抗氧化、抗衰老，可消除H2O2產生自由基而損傷細胞膜的危害，同時GSH-Px還可以提高人體免疫力，增進血球制造保護物質的功能，保護身體免受感染，降低細胞制造發炎物質的總量。

血管的增生除了與血管內皮細胞的增殖有關外，還受血管內皮細胞凋亡的影響[15]。細胞凋亡導致細胞核內的DNA因漏出而減少，故在流式細胞儀圖形上，出現凋亡細胞峰。H2O2組細胞因氧化損傷大量凋亡，加入大黃酸預處理后，大大減少了凋亡率，保持了內皮細胞的正常活力和生理功能。

綜上，大黃酸在2～16μmol/L濃度條件下，無顯著細胞毒性；內皮細胞經H2O2處理后，細胞膜氧依賴性酶及細胞膜結構受到影響，細胞膜通透性顯著提高，LDH釋放率、MDA含量顯著升高，NOS、NO等活性物質和重要因子分泌量減少，SOD、GSH得不到補充，自由基清除能力下降，細胞凋亡率上升。大黃酸預處理后，因為大黃酸本身的氧化還原能力，同時改善了內皮細胞的增殖情況，減少了LDH釋放率，抵御了細胞的過度脂質過氧化，NOS、NO、SOD、GSH等活性物質的分泌量回升，防止細胞發生凋亡，維持了細胞正常的生理形態，保護了內皮細胞，阻止AS的發生和發展。

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Proliferative and Protective Effects of Rhein on Normal and Oxidatively Injured Endothelial Cells

ZHONG Xian-feng1,2，LUO Ting1，DENG Ze-yuan1,*，LIU Rong1，FAN Ya-wei1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China)

Objective: To study the effect of rhein on the proliferation and oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods: An oxidative injury model was established with H2O2. HUVECs were incubated with rhein at various concentrations and the availability of rhein for protecting endothelial cells was explored. The release rate of lactic acid dehydrogenase (LDH), the contents of malondialdehyde (MDA) and NO, and the activities of nitrogen oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were determined. Flow cytometry was employed to investigate the apoptosis of HUVECs. Results: Rhein had no obvious effect on the proliferation of HUVECs when the concentration of rhein was less than 16 μmol/L. However, rhein at a concentration of more than 2 μmol/L could reveal significant protection against oxidative damage in HUVECs. The release rate of LDH and the content of MDA revealed an obvious decrease, whereas the content of NO and the activities of NOS, SOD and GSH-Px exhibited an obvious increase. The rates of apoptosis and necrosis were reduced significantly. Conclusion: Rhein can maintain the normal physiology of the cells and prevent the cells from H2O2-induced injury at a concentration of 2—16 μmol/L. It is particularly important for the prevention and treatment of atherosclerosis.

rhein；oxidative damage；endothelial cells；proliferation

R151

A

1002-6630(2012)11-0257-05

2011-06-29

江西省研究生創新專項資金項目(YC10A016)；食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題(SKLF-TS-200921)

鐘先鋒(1981—)，男，講師，博士研究生，研究方向為抗動脈粥樣硬化藥物篩選。E-mail：zhongxf81@126.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向為脂肪與健康。E-mail：dengzeyuan28@yahoo.com.cn