脂多糖聯合α-干擾素抑制體外白血病細胞株U937的增殖及凋亡效應研究

劉倩平 鄒三鵬 章志福

α-干擾素(IFN-α)能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖，能夠增加NK細胞和其他一些活性免疫細胞功能，有較強的抗腫瘤活性，其發揮抗腫瘤作用的機制是通過直接抑制腫瘤細胞的增殖與分化，目前IFN-α在臨床上已被廣泛用于血液系統腫瘤的治療［1］。Toll樣受體為介導天然免疫反應并觸發或橋接適應性免疫的模式識別的一類受體，這類受體在U937細胞中表達。作為Toll樣受體的主要外源性配體之一的內毒素脂多糖(LPS)，可與Toll樣受體結合后通過信號轉導的級聯效應產生抑制U937的增殖［2］。本文旨在研究LPS在體外是否具有增強IFN-α抑制白血病細胞株U937細胞增殖效應和機制。為TLR配體或其激動劑協同佐劑IFN-α免疫治療白血病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(FBS)(天津市灝洋生物制品科技責任有限公司，批號:100413);二甲亞砜(DMSO)溶液、四甲基偶氮唑藍(MTT)(北京SABC公司產品);EL301型酶標儀(美國Bio-Tek公司);人白血病細胞株U937細胞自購進后復蘇使用。

1.2 方法

1.2.1 U937細胞增殖抑制率的測定 人白血病細胞株U937細胞常規離心棄上清復蘇，復蘇后的細胞在加熱滅活的10%FBS 及 100μg/ml鏈霉素、100 Μ/ml青霉素的 RPMI1640的培養基中，置于37℃、濕度飽和及5%的CO2孵箱中培養，平均每3天對培養基進行更換并傳代一次。依據處理U937細胞的藥物不同對實驗進行分組，實驗組:A組(單用IFN-α 0.1μg/ml)、B 組(單用 LPS 0.1μg/ml)，C 組(兩藥等劑量合用);另設空白對照組。經藥物處理后的U937細胞，混勻后，移取100 μl至96孔培養板中，細胞濃度約為5×105ml，每組重復8孔，最終每孔體積為0.2ml。置37℃、濕度飽和及5%的CO2孵箱中培養;培養液3 d更換一次。于培養終止前4 h每孔中加入20 μL MTT(5 mg/ml)，4 h后離心(3000 rpm·min，5min)，將上清棄去，然后每孔加入DMSO 150 μL以終止培養。使用酶聯免疫檢測儀測定其吸光度，以此計算細胞增殖抑制率〔細胞增殖抑制率(%)=(l-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%〕。

1.2.2 U937細胞凋亡率的檢測 100 μL人白血病細胞株U937細胞置于含10%FBS的RPMI1640培養基中培養過夜，細胞密度調節至5×106/ml，Binding緩沖液洗滌一次，另取100 μL Binding緩沖液重懸，移取 5 μL AnnexinV-FITC 加入，置暗處孵育20min，移取10 μL濃度為1 mg/ml的AnnexinV/碘化丙錠，室溫下暗處孵育20min，Binding緩沖液洗滌后重懸，立即檢測，獲取參數并進行數據分析。

1.3 統計學方法 所有數據錄入Excel中初步處理后，采用SPSS 17.0統計學軟件包進行數據處理，計量資料以均值±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

各組給予不同藥物與U937細胞作用2 d后，與對照組比較，各實驗組的抑制率(%)和凋亡率(%)均顯著升高(P＜0.05);實驗組組內比較，兩藥等劑量合用較單用的抑制率(%)和凋亡率(%)亦均顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 IFN-α和/或LPS對U937細胞增值的抑制率和細胞凋亡率的影響()

表1 IFN-α和/或LPS對U937細胞增值的抑制率和細胞凋亡率的影響()

注:*與對照組比，各實驗組均有統計學意義(P＜0.05);#C組分別比較A、B組有統計學意義(P＜0.05)

組別 抑制率(%) 凋亡率(%)A組 0.41±0.05* 0.36±0.03*0.06±0.02 0.07±0.04實驗組 B組 0.33±0.01* 0.30±0.02*C組 0.72±0.06*# 0.63±0.05*#對照組

3 討論

急性白血病的發生和發展比較復雜，具有多階段、多步驟、多基因的特點。IFN-α抗腫瘤的活性較強，臨床上已廣泛應用于惡性血液系統腫瘤治療并有較好療效［3］。其發揮抗腫瘤的效應的主要機制是調節細胞免疫活性或抑制腫瘤細胞的增殖［4］。LPS為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要組成成分，其對應的受體是Toll樣受體8，通過激動或抑制該受體在白血病細胞株U937的表達而達到干預的作用［5］。本實驗結果顯示，IFN-α或LPS對U937細胞的增殖率和凋亡率均有明顯的升高作用，而等劑量合用后這一作用顯著增強。為佐劑IFN-α聯合Toll樣受體配體或其激動劑免疫治療白血病提供了新的思路。

［1］熊芳，王興兵，張佳華，等.Toll樣受體在U937細胞的表達及其作用研究.中國實驗血液學雜志，2007，15(3):449-452.

［2］Huang B，Zhao J，Unkeless JC，et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword.Oncogene，2008，27(2):218-232.

［3］王曉桃，林文遠，陳蓓莉，等.α-干擾素聯合脂多糖對白血病細胞株U937細胞周期的影響及其機制研究.中國全科醫學，2011，14(10 c):3457-3459.

［4］Lee WH，Liu FH，Lee YL，et al.Interferon-alpha induces the growth inhibition of human T-cell leukaemia line Jurkat through p38alpha and p38beta.J Biochem，2010，147(5):645-650.

［5］陳蓓莉，王曉桃，林文遠，等.α-干擾素聯合脂多糖在體外抑制急性髓系白血病細胞株U937和HL60增殖的效應.重慶醫學，2010，39(23):3162-3164.